Network Interface Transmit Descriptor Ring The network interface transmit descriptor ring (NITDR) contains a

Existe um visível interesse em estudar inibidores de proteases (IPs). Estudo clássico já menciona que os inibidores de proteases estão presentes em múltiplas formas nos reinos animal, vegetal e em micro-organismos; buscando classificar os inibidores conhecidos conforme classe de família, além de discutir mecanismo de ação desses inibidores (LASKOWSKI JR.; KATO, 1980).

Os IPs são, naturalmente, reguladores de enzimas proteolíticas. Como dimensão da importância desses inibidores, é descrito que um genoma típico de um organismo é composto por cerca de 2 a 4% de genes que codificam para diversas proteases. As proteases são elementos críticos para diversos eventos biológicos como digestão, cicatrização, replicação viral, cascata de coagulação sanguínea, entre outros. Esses processos devem ser regulados com muita precisão, visto que, quando desregulados, alteram o equilíbrio homeostático podendo trazer consequências irreversíveis. Assim, os IPs são elementos fundamentais de regulação (FARADY; CRAIK, 2010).

Tamanha importância têm os IPs que há um investimento do mercado global na área de síntese de inibidores enzimáticos avaliado em US$ 104,4 bilhões no ano de 2010, e a taxa de crescimento anual nesse ramo é de 4%, segundo BCC

Research Reports (https://www.bccresearch.com/) (DABHADE; MOKASHE; PATIL,

2016).

Há uma gama de medicamentos comercializados que tem como mecanismo de ação a inibição de enzimas, entre eles, a notável classe das estatinas, que são inibidores de uma enzima chave no processo de síntese de colesterol, a hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase (FONSECA, 2005). Ademais, há investimento em pesquisas com inibidores de proteases para o tratamento do câncer, em que são mencionados como potenciais agentes terapêuticos (EATEMADI et al., 2017). A pesquisa com inibidores de proteases com esse potencial vem sendo estudada e aplicada em tratamento de outras doenças, tais como: síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e hipertensão (FEAR;

KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007). Dessa forma, é possível constatar a importância dos estudos com essas moléculas.

Há, classicamente, quatro famílias dos IPs, conforme o tipo de protease que inibem: serino, cisteíno, aspártico e metalo-protease (RYAN, 1990). Existe uma classificação atual conforme similaridade de aminoácidos, identificados na sequência do IP, que podem ser agrupadas em 6 superfamílias, englobando, assim, a classificação clássica: serpina, kunitz, cisteíno, Bowman Birk, inibidor metalopeptidase e aspartil (RAWLINGS; TOLLE; BARRETT, 2004; SHAMSI; PARVEEN; FATIMA, 2016).

A família serpina possui alto peso molecular: entre 39 e 43 kDa. Os inibidores dessa família têm sido purificados e caracterizados principalmente de sementes de cereais com aplicação na vertente medicinal, como controlador de processo inflamatório e coagulação. Já a família Kunitz possui inibidores, geralmente, de 18 a 22 kDa, com duas pontes dissulfeto e único sítio reativo, também com aplicação medicinal. Os da família Bowman Birk com peso molecular de, aproximadamente, 8 kDa, têm sido alvo para estudo em células de câncer de mama. Os IPs metalo são ainda menores, cerca de 4,2 kDa; enquanto os da família aspartil possuem massa molecular de 27 kDa, e os IPs cisteíno possuem subdivisão com diferentes massas moleculares que variam entre 11 a 120 kDa (SHAMSI; PARVEEN; FATIMA, 2016).

Os inibidores de tripsina são amplamente extraídos de sementes, purificados e caracterizados para uso em diversas pesquisas (SOUZA et al., 2016). O tamarindo se apresenta como uma semente rica em diferentes inibidores de tripsina. Entretanto, os inibidores de tripsina do tamarindo, ainda são pouco estudados, alguns autores isolaram (FOOK et al., 2005; RIBEIRO et al., 2015) e outros purificaram diferentes inibidores (ARAÚJO et al., 2005; PANDEY; JAMAL, 2014), porém com objetivos de estudo diferentes.

Há depositadas, no banco de dados de proteínas do NCBI (National

Center for Biotechnology Information), três sequências primárias de inibidor de

tripsina do tamarindo. Uma delas é uma proteína composta por 185 resíduos de aminoácidos, cuja sequência, deduzida a partir de cDNA, é parcial e não publicada em revista científica (código de acesso: ADO51067.1) (NCBI, 2016). As outras duas sequências são designadas como cadeia A e B de inibidor de tripsina de tipo kunitz

35 com atividade inibidora do fator Xa, ambas com 185 resíduos de aminoácidos, também deduzidas por cDNA (PATIL et al., 2012).

Com a purificação de uma proteína, é possível sequenciá-la e caracterizá-la bioquímica e funcionalmente. A caracterização bioquímica e molecular: sequenciamento, determinação de estruturas tridimensionais, especificidade de inibição para classes de peptidases e mecanismos de inibição são essenciais, objetivando o potencial uso dessas proteínas para diferentes fins, incluindo fitoterápico ou medicamento (FAN; WU, 2005; OLIVEIRA et al., 2002; RYAN, 1990). Entretanto, apesar da pressão para reduzir os custos na investigação de novos fármacos de origem natural, uma vez que demanda alto custo para a purificação do princípio ou componente ativo, a separação, purificação e caracterização de produtos naturais são consideradas a base do processo de desenvolvimento dos biofármacos (PRZYBYCIEN; PUJAR; STEELE, 2004).

1.3.1 Cromatografias para purificação de proteínas

O processo de purificação de proteínas exige combinação de técnicas de separação que variam conforme as características estruturais e a natureza da moléculas de interesse (SANTOS et al., 2012). Entre essas técnicas, destacam-se as cromatografias, que são métodos físico-químicos de separação e compreendem diversos tipos, tais como as de troca iônica, exclusão molecular e afinidade. Geralmente, essa metodologia cromatográfica são combinadas, entre os diversos tipos, a fim de se obter uma melhor resolução no processo de purificação de proteínas (MORAES et al., 2013).

As cromatografias de afinidade, especialmente, são as técnicas dominantes no processo de purificação de proteínas, permitindo uma boa eficiência na separação de componentes similares numa mistura complexa, importantes para definir sua especificidade de ligação com as diversas enzimas que podem estar imobilizadas na fase estacionária. Dessa forma, a purificação pode ser grandemente aumentada, utilizando essa propriedade de afinidade entre a molécula de interesse e o agente de ligação (ARAÚJO et al., 2014; GOTTSCHALK; BRORSON; SHUKLA, 2012; SANTOS et al., 2012).

No entanto, em algumas circunstâncias, outras técnicas cromatográficas mais robustas e especializadas se fazem necessárias, tais como, a

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, do inglês High performance liquid

chromatography - HPLC). Esse é um instrumento sofisticado e com capacidade de

separação e quantificação de moléculas com alta resolução por meio de colunas modernas (LANÇAS, 2009). Essa técnica automatizada permite análise e purificação em larga escala, sendo possível lançar mão das diferentes características químicas das proteínas em diversas colunas com propriedades distintas (SALVATO; CARVALHO, 2010).

1.3.2 Análise de proteínas por espectrometria de massa

A espectrometria de massa (EM) é uma técnica de alta resolução e amplamente utilizada, sendo uma tecnologia essencial para análise química qualitativa (MILMAN, 2015). Avanços tecnológicos são constantes para EM, uma vez que é uma ferramenta indispensável para estudar química de proteínas, além de ser um campo central para a proteômica (STEEN; MANN, 2004).

Diversos estudos vêm discutindo a importância e aplicabilidade da EM para diferentes áreas, entre elas, a pesquisa na clínica médica, para diagnósticos por meio de análise de exames laboratoriais (FUH; HEIKAUS; SCHLÜTER, 2016); na ciência dos alimentos, verificando a composição química e segurança alimentar (BARBERA et al., 2017; CASTRO-PUYANA et al., 2017) e em biofármacos, como é o caso das proteínas terapêuticas. Essas possuem complexidade estrutural, sendo extremamente importantes para sua eficácia e é de fundamental importância a caracterização química para que possa ter um controle de qualidade. Para tanto, a EM permite uma variabilidade de abordagens no estudo de biofármacos proteicos, o que torna essa técnica valiosa desde a descoberta até a aprovação de uma proteína terapêutica. Sem dúvidas, essas análises apresentam grande impacto na área biofarmacêutica (KALTASHOV et al., 2012).

Esse método analítico é capaz de detectar, em razão da massa molecular e carga (m/z), íons analito. Diversas fontes de ionização são utilizadas, entre elas, ionização e dessorção a laser assistida por matriz (do inglês, Matrix-

assisted laser desorption/ionization - MALDI) e ionização por eletrospray (do inglês,

electrospray ionization – ESI), assim como vários analisadores são utilizados, tais

como quadrupolo (Q) e o tempo-de-voo (do inglês, Time of flight - TOF), ou ainda associado como quadrupolo-tempo de voo (Q-TOF) (SCHERL, 2015).

37 A junção técnica desses dois analisadores, TOF e Q-TOF, resulta em um equipamento de alta resolução, boa sensibilidade e rapidez de varredura para gerar os espectros. Sua aplicabilidade é muito ampla, principalmente para picos cromatográficos estreitos (LANÇAS, 2009). Diferente das técnicas de sequenciamento por cDNA, o sequenciamento e a massa molecular obtida por meio das técnicas de ionização são amplamente empregadas nas análises de substâncias de importância bioanalítica, alimentícia e farmacêutica (KÖCHE; ENGSTRÖM; ZUBAREV, 2005; LANÇAS, 2009).

1.3.3 Parâmetros de especificidade e resistência proteica

Quanto à caracterização de inibidores, avaliar a estabilidade a temperatura e de pH (potencial hidrogeniônico) e a cinética enzimática da inibição, são informações de extrema importância, na área de biotecnologia de proteínas. Por meio da temperatura e pH, é possível esclarecer os limites extremos da bioatividade dessas moléculas (PRZYBYCIEN; PUJAR; STEELE, 2004).

Já quanto ao esclarecimento sobre a cinética enzimática desses inibidores é possível identificar o tipo de inibição, a Ki (constante de inibição) e a IC50

(concentração mínima para que ocorra a inibição). A cinética enzimática reversível pode ser classificada, basicamente, em duas formas: competitiva e não competitiva. Na competitiva, a estrutura do inibidor é semelhante à do substrato, competindo, de fato, pelo sítio ativo da enzima. Já a não competitiva, o inibidor liga-se em um local distinto do sítio ativo da enzima e provoca alteração na sua conformação estrutural, dessa forma, o substrato não se ligará mais de forma eficaz na enzima (MORAES et al., 2013; NELSON; COX, 2013).

Há várias abordagens para estudar o mecanismo de ação de uma proteína purificada, e uma das mais importantes continua sendo a mais antiga, que é por determinação da velocidade de reação e como ela se altera em resposta a mudanças nos parâmetros experimentais (NELSON; COX, 2013). Essas informações são essenciais para o estudo de potenciais biofármacos (GOTTSCHALK; BRORSON; SHUKLA, 2012).

Nesse sentido, purificar, sequenciar e caracterizar bioquímica e funcionalmente esses inibidores de proteases não é simples, no entanto se

apresenta como o caminho mais seguro e promissor na bioprospecção de novos bioprodutos, bem como biofármacos.