LANCE Operation

Caracterizar um inibidor de protease é fundamental para sua classificação. Conhecer suas propriedades é um fator indispensável para poder lançá-lo como candidato à um ativo biotecnológico. Além de pesquisas para uso na agricultura, diversos inibidores de proteases são caracterizados e estudados em doenças humanas: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), Alzheimer, osteoporose, doenças cardiovasculares, artrite reumatoide, câncer, obesidade e outros (DAVIS et al., 2012; HAQ et al., 2010; JEDINÁK; MALIAR, 2005; SHAMSI; PARVEEN; FATIMA, 2016; CARVALHO et al., 2016).

Assim, buscou-se purificar um inibidor de tripsina da semente do tamarindo, uma vez que, na literatura já existem relatos do efeito antiobesidade em ratos Wistar eutróficos e anti-inflamatório em animais com obesidade, de inibidores parcialmente purificado, provenientes dessa semente (CARVALHO et al., 2016; RIBEIRO et al, 2015;). Além disso, a análise química desse inibidor purificado, o ITTp, se faz importante, uma vez que ainda não há relatos dessa caracterização.

No processo de purificação do ITTp, a etapa relacionada à atividade específica, em que o inibidor purificado apresenta maior potência UI/mg de proteína, comprova o aumento do potencial de inibição dessa proteína à medida que foi sendo purificada. A recuperação também é um item a ser destacado, em que foi obtido aproximadamente 2%, tendo como referencial de partida o EB. O rendimento do processo de purificação é um dado importante no estudo com esses inibidores com potencial bioativo, uma vez que envolvem várias etapas, sendo assim desafiador. São cruciais as etapas bem delimitadas, com alta reprodutibilidade e executadas para se obter o maior rendimento possível (OLIVEIRA et al., 2012).

Assim, o ITTp foi obtido e as massas moleculares protonada acurada por meio da técnica de ionização por ESI, em sua forma nativa, para Fr1 e Fr2 de ITTp estavam dentro do intervalo de massas moleculares características dos inibidores de tripsina da família kunitz(SHAMSI; PARVEEN; FATIMA, 2016). Um inibidor de tripsina, também de sementes de tamarindo, já havia sido purificado, entretanto a massa molecular apresentada é diferente, com 21420,17 Da, analisada por MALDI-TOF (ARAÚJO et al., 2005).

A massa molecular acurada obtida por meio da técnica de ionização por ESI apresenta bastante robustez, e é amplamente empregada, principalmente,

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para análise de proteínas, aminoácidos e substâncias de importância bioanalítica, alimentícia e farmacêutica, sendo útil para definir a sua identidade (LANÇAS, 2009).

Além disso, com a reação de redução e alquilação foi possível estimar o número de Cys presente na estrutura da Fr2.1. O processo de redução por DTT é capaz de clivar pontes dissulfeto formadas por enxofre (S) presente na cadeia lateral de Cys. E a alquilação por IAA provoca modificação adicional formando (– SH), para impedir a reformação da ligação dissulfeto (NELSON; COX, 2013). Assim, foi visto mais uma evidência de se tratar de um inibidor do tipo kunitz, por apresentar cerca de 4 Cys, capaz de promover duas pontes dissulfeto (SHAMSI; PARVEEN; FATIMA, 2016).

A análise por MALDI-TOF ISD, para obtenção parcial da estrutura primária dos picos proteicos majoritários após redução e alquilação, foi de grande valia para sugerir que se tratava da mesma molécula, por ter sido obtido exatamente a mesma sequência aminoacídica. Na técnica por ISD ocorre clivagem da ligação N- Cα, resultando em fragmentos do tipo –c e –z. ISD pode ser aplicado para sequenciamento de peptídeos, não muito pequenos, e proteínas devido à região m/z baixa ter incompreensível análise devido o aglomerado de matriz (KÖCHE; ENGSTRÖM; ZUBAREV, 2005). Dessa forma, foi possível visualizar a sequência de resíduos de aminoácidos acima da região 1000 m/z.

No alinhamento múltiplo realizado, utilizando como ferramenta de busca o BLASTp, foi encontrado inibidor de tripsina de tamarindo parcialmente sequenciado a partir de cDNA. Com essas sequências, foram vistos alta identidade, nenhum agp e baixo e-value. Os gaps representam deleções ou inserções e a alta identidade, 91% para as duas primeiras sequências e 89% para a terceira, indica, em percentual, o número de letras similares identificadas no alinhamento. E o valor de e-value é inversamente proporcional à probabilidade de alinhamento ter ocorrido simplesmente pelo acaso, ou seja, quanto menor o e-value, maior garantia de alinhamento fidedigno (AMARAL; REIS; SILVA, 2007). Dessa forma, a sequência obtida condiz com as já depositadas, contudo, a sequência parcial do ITTp foi obtida da molécula purificada da própria semente e não deduzida por cDNA.

O alinhamento com as demais sequências apresentou maior identidade com inibidores de tripsina de plantas e sementes do tipo kunitz. Considerando que, neste estudo, as frações purificadas são a mesma molécula, é sugerido que o ITTp pertence à família dos inibidores do tipo Kunitz.

Adicionalmente, com o inibidor puro, o estudo cinético permitiu conhecer seu mecanismo enzimático, divididos, basicamente, em duas classes: reversível e irreversível (NELSON; COX, 2013). Os parâmetros de especificidade dão informações importantes quanto ao mecanismo de ação entre o inibidor e a protease. A Ki é a constante de dissociação (MARQUES; YAMANAKA, 2008) dada

como o grau de interação entre o inibidor e a protease, a Ki do ITTp foi de 2,9 x 10-11 Mol; conforme o gráfico determinado por Dixon; Webb, (1979), é possível afirmar que se trata de um inibidor competitivo, devido às duas linhas, correspondentes a cada concentração do substrato, terem seu ponto de intersessão acima do eixo X (ODDEPALLY; SRIRAM; GURUPRASAD, 2013). O inibidor de tripsina purificado por Araújo et al. (2004), apresentou valor da Ki de 1,7 x 10-9 Mol, com cinética não

competitiva, demonstrando de fato não se tratar do mesmo inibidor purificado neste estudo, mesmo que oriundos da mesma semente.

Desse modo, ao comparar esses inibidores de tripsina, percebe-se que o ITTp é uma molécula que apresenta uma forte interação competitiva com a tripsina; por isso, revela-se como um inibidor candidato à aplicação farmacêutica, uma vez que inibidores com essa característica sobressaem dos não competitivos (LI et al., 2004). Muitos medicamentos possuem cinética competitiva; têm-se como um exemplo clássico, as estatinas, que competem de forma reversível, com a 3- hidroxi-3-metil-glutaril-CoenzimaA (HMG-CoA) pelo sítio ativo da enzima HMG-CoA redutase, inibindo a síntese de colesterol (FONSECA, 2005).

Com relação à IC50 do ITTp que resultou em 2,7 x 10-10 M, é possível

compará-lo a outros inibidores de tripsina. Algumas pesquisas trazem valores da IC50 de inibidores de tripsina purificados, tais como: o EvTI que possui IC50 de

2,2x10-8 Mol (MACHADO et al., 2013) e o inibidor de tripsina de sementes de Entada

scandens (ESTI) apresenta 2,64x10-8 Mol (LINGARAJU; GOWDA, 2008). Verifica-se

que, comparado a outros inibidores de tripsina, tem-se uma proteína com potencial, visto que é necessária uma quantidade menor do que aqueles aqui apresentados para obter 50% de atividade antitríptica, o que favorece a bioprospecção do ITTp.

A caracterização bioquímica, em relação ao comportamento do ITTp, quanto aos agentes desnaturantes, como escala de pH e temperatura, é outro fator importante que deve ser investigado. Sabe-se que o pH altera a natureza e a distribuição de cargas de uma proteína, variando conforme a composição aminoacídica da proteína. Comumente, as proteínas são mais solúveis em pH ácido

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ou alcalino; isso acontece por repulsão eletrostática devido ao excesso de carga de mesmo sinal, o que favorece maior camada de solvatação e redução de formação de agregados. Por outro lado, os extremos de pH podem provocar desnaturação proteica, devido à exibição de regiões hidrofóbicas, podendo ocasionar interações hidrofóbicas e precipitação. Com relação à proteína em um meio com um pH semelhante ao seu pI ocorre aproximação e agregação da proteína, já que não possui carga para que haja repulsão eletrostática, esta é diminuída e as proteínas com carga nula aproximam-se e se agregam (MORAES et al., 2013).

Analisando os resultados de ITTp, observa-se um inibidor com resistência aos extremos de pH, já que mantém sua atividade antitríptica tanto em pH ácido quanto alcalino. Assim, é percebida uma redução do percentual de inibição, apenas entre o pH 6 e 8, podendo ser explicado pelo valor estimado do pI do ITTp; nesses valores de pH as suas moléculas apresentam redução da repulsão eletrostática, pois estão com carga líquida zero ou próxima de zero, o que provoca o efeito explicado anteriormente: cargas nulas provocam a redução da repulsão eletrostática, fazendo com que o ITTp agregue-se, dessa forma, explicando a redução da sua atividade antitríptica nessa faixa de pH.

Quanto à temperatura, sabe-se que, também, influencia na função da proteína. A maioria das proteínas é desnaturada pelo calor, pois alteraram a estrutura tridimensional, consequentemente há perda total ou parcial de sua função. A alteração estrutural se dá nas ligações fracas, principalmente, nas ligações de hidrogênio, acarretando agregação e precipitação (NELSON; COX, 2013). O ITTp mantém sua atividade antitríptica, relativamente estável até 80 ºC, que a qualifica como proteína termorresistente; quando em 100 ºC há uma redução da sua função estudada, mas ainda assim, mantém cerca de 67% de inibição de tripsina.

A termorresistência de uma proteína está relacionada ao dobramento da proteína, o qual pode envolver forças não covalentes (pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, força de van der Walls e pareamento de íons) e forças covalentes (como pontes dissulfeto). Essa característica é de fundamental importância, uma vez que diversos processos biotecnológicos são realizados em altas temperaturas, como síntese de um novo medicamento, e por isso, quanto mais termorresistente for o inibidor, mais promissor na perspectiva de obtê-lo em larga escala (GOMES et al., 2007).

O gel bidimensional, consequentemente, apresentou alguns spots, com pI entre pH 5 e 6, e ainda spot na região de pH 8. Tratando-se de isoformas, os spots são comuns e podem ser numerosos, tornando, assim, o processo de identificação desafiador (CANTÚ et al., 2008).

A reavaliação funcional desse inibidor, agora purificado, sobre CCK e leptina em ratos Wistar com obesidade reafirmou o que já havia sido encontrado quando utilizado o inibidor parcialmente purificado nos estudos de Costa et al (2017). Não havendo, portanto, perdas da sua atividade quanto à redução da concentração plasmática de leptina, tampouco modificações sobre as concentrações plasmáticas de CCK. A resistência á leptina e, consequentemente, à hiperleptinemia é uma condição metabólica acometida na obesidade (SÁINZ et al., 2015), o ITTp proporcionou uma melhora nesse perfil. Lartigue et al. (2012) demonstraram, em seu estudo, a interação de CCK com a leptina e a importância da redução da resistência à leptina em animais com obesidade para melhorar a ação sacietogênica de CCK.

O ITT, apenas parcialmente purificado em estudo prévio (COSTA et al., 2016), e o ITTp, molécula essa pura avaliada neste estudo, não provocaram aumento de CCK. No entanto, também com o inibidor de tripsina ainda parcialmente purificado, já havia sido constatado o efeito significativo sobre a redução do consumo alimentar, mesmo sem consequente diminuição do ganho de peso, em 10 dias de experimentos, em animais com obesidade (CARVALHO et al., 2016). Dessa forma, reforça-se a hipótese de que a ação de ITT e ITTp relacionada à saciedade, no estado de obesidade, está na dependência da sua ação sobre leptina e não sobre CCK, como visto para animais eutróficos (RIBEIRO et al., 2015).

Vale ressaltar que a redução da sensibilidade à CCK em animais com obesidade chega a ser tratado como fator patogênico para continuidade dessa condição metabólica, uma vez que, mesmo em doses fisiológicas administradas em ratos com obesidade, não há o efeito sacietogênico como ocorre com animais eutróficos (MEEREIS-SCHWANKE et al., 1998). Em ratos Sprague-Dawley, com obesidade induzida por dieta, somente depois de 23 dias recebendo CCK-8 exógeno, pôde-se observar redução do peso animal (MHALHAL et al., 2016).

Desse modo, supõe-se que, em um tempo maior de experimento, o secretagogo de CCK isolado ou purificado das sementes de tamarindo poderia apresentar melhores resultados relativos ao controle do apetite e, consequentemente, à perda de peso, considerando que provocou redução do

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consumo alimentar em animais com obesidade em 10 dias de tratamento. Assim, em um maior período de tratamento, elevando CCK ou mesmo sem apresentar esse efeito mas, pelo fato de melhorar a condição de resistência apresentada pela alta concentração de leptina em animais com obesidade, poderia culminar, apresentando, além do efeito sobre a redução do consumo alimentar (CARVALHO et al., 2016), também, a redução do ganho de peso.

Animais com obesidade que apresentam concentração de leptina reduzida são mais sensíveis à leptina endógena e também a CCK (CRUJEIRAS et al., 2015; LARTIGUE et al., 2012); assim, uma redução na concentração plasmática de leptina é um efeito promissor do ITTp, pois recorre a uma regulação na sinalização que envolve a saciedade.

Ademais, Carvalho et al (2016), em seu estudo com animais com obesidade que receberam ITT, demostraram que esses apresentaram concentrações plasmáticas de TNF-α reduzida, independente da perda de peso. Isso levou a crer, somados aos resultados obtidos neste estudo, que a ação de ITT e ITTp extrapolam as relacionadas às suas atividades antitrípticas e consequente aumento de CCK, com posterior efeito sacietogênico. Foi sugerida para essa molécula purificada também uma importante função anti-inflamatória.

Dessa forma, o conhecimento bioquímico dessa molécula e o seu efeito sobre leptina em modelo experimental de obesidade, é um feito promissor e fornece informações essenciais e inovadoras para uma biomolécula de provável aplicação biotecnológica, por meio de sua sequência aminoacídica sintetizada.