Mutagénèse dirigée et production de mutants de Zg-VIPO1

Afin d’étudier ces mécanismes, nous avons décidé d’utiliser une approche par mutagenèse dirigée. Cette méthode permet de substituer de manière spécifique un résidu par un autre et de caractériser le rôle des différents résidus potentiellement impliqués dans le cycle catalytique.

Les premières cibles visées dans cette étude ont été tout d’abord la boucle présente à l’entrée du site actif, ainsi que la tyrosine (Tyr263) obstruant l’entrée. La Tyr263 a été substituée par des résidus plus ou moins hydrophobes ou présentant des propriétés chimiques proches (Table

IV.11). En parallèle nous avons aussi tenté de supprimer la boucle par PCR (protocole présenté dans la Figure IV.57), cependant cette approche n’a pas été couronnée de succès. εous nous

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sommes donc concentrés sur les trois mutations ponctuelles de la Tyr263, pour étudier le rôle de la boucle (Table IV.11).

Dans le site actif de Zg-VIPO1, 7 résidus sur les 9 présents ont été modifiés par mutagenèse dirigée (Table IV.11). Les deux histidines ont été mutées en alanine afin d’éteindre la fonction de ces résidus. L’histidine catalytique (His360) a aussi été mutée en sérine. En effet, un groupe formé de VHPO d’origines diverses (algues et Actinobactéries) présente dans leurs séquences une substitution de l’histidine catalytique par une sérine. Cette mutation permet donc d’explorer l’activité des enzymes de ce groupe.

Les mutants Ser358Ala et Trp321Arg visent à mimer partiellement les sites actifs respectifs de Ld-VIPO1 et Cp-VBPO ou Co-VBPO. Le mutant Phe353His mime totalement le site actif d’An-VBPO1. Enfin, les deux arginines présentes dans le site actif sont mutées en alanine afin d’étudier leurs rôles dans le cycle catalytique.

Finalement, l’analyse des réseaux de liaisons d’hydrogènes a permis d’identifier des résidus en contact avec ceux présents dans le site actif, pouvant modifier soit leurs orientations, soit la force des liaisons hydrogènes qu’ils forment avec le vanadate. De plus, les résidus présents chez Zg-VIPO1 sont différents de ceux observés chez Ci-VCPO et An-VBPO1. Dans la seconde sphère de coordination du vanadate, trois acides aminés ciblés sont soit mutés en alanine, soit substitués par le résidu présent chez Ci-VCPO ou An-VBPO1 (Table IV.11).

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Table IV.11 - Production et analyses des mutants de Zg-VIPO1, obtenus par mutagenèse dirigée. Certains mutants de

Zg-V)PO ont pu être étudiés au niveau structural par des approches d’absorption de rayon X XAS et de diffraction des rayons X (DRX)

Nom Mutagenèse Clonage Purification Activité

enzymatique XAS Cristallogenèse DRX B ou cl e Tyr263Ala      Tyr263Phe     Tyr263Ser     Délétion-boucle × Si te a ct if Trp321Arg     Arg326Ala   × Phe353His       Ser358Ala     His360Ala        His360Ser     His416Ala × Arg410Ala     2 nd sp hè re Cis320Ala   × Cis320Ser     Asp322Ala   × Asp322Lys     Asp322Tyr     Glu415Ala   × WT      

Figure IV.57 - Protocole pour supprimer par PCR la boucle obstruant le site actif chez Zg-VIPO1. Les régions en amont

et en aval de la séquence codant pour la boucle du gène zg-vipo1 sont amplifiées par PCR (PCR #1 et #2). Les amorces internes )nt ’ et )nt ’ permettent d’insérer une nouvelle séquence plus courte. Les produits des deux premières PCR sont ensuite fusionnés par PCR (PCR #3). Deux sites de clivages nécessaires au clonage sont ajoutés au dernier produit de PCR (PCR #4) pour le clonage dans un plasmide pGEM-t.

Sur les 18 mutants envisagés, 16 mutagénèses ciblées ont abouti après deux séries d’expériences successives. Seuls les mutants visant à supprimer la boucle et à substituer l’His416 par une alanine n’ont pas été obtenus après le second essai. La présence de la mutation et l’intégrité de la séquence codante ont été vérifiées par séquençage, puis la souche d’expression BL21(DE3) a été transformée avec les plasmides pFO4-zg-vipo1XnnnX dans le but de produire les protéines mutées de Zg-VIPO1.

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Des tests de surexpression ont été menés dans des cultures de 15 mL de milieu de culture auto-inductible ZYP5052 [Studier, 2005] et la surexpression a été contrôlée dans le lysa bactérien par SDS-PAGE. Ces analyses par SDS-PAGE ne montrent pas de bandes dans la fraction soluble du lysat pour les mutants Arg326Ala, Cis320Ala, Asp322Ala et Glu415Ala. Ces mutants sont peut-être instables. Les protocoles de lyse ou de purification utilisés devront être optimisés pour eux, en modifiant par exemple les concentrations en sel et en ajoutant du vanadate dans le tampon de lyse.

Les 16 protéines mutantes solubles sont donc produites dans un plus grand volume de milieu de culture auto-inductible ZYP5052, puis les protéines recombinantes sont purifiées par chromatographie d’affinité. Le rendement de purification est variable entre les mutants. Ainsi le mutant Phe353His est fortement surexprimé et purifié en grande quantité (Figure IV.58-A). D’autres mutants comme Trp321Arg ou Ser358Ala sont exprimés avec un faible rendement et nécessitent plusieurs purifications successives, afin d’obtenir les quantités de protéines nécessaires pour les analyses suivantes (Figure IV.58-B).

Figure IV.58 - Purification des mutants Zg-VIPO1 Phe353His (A) et Ser358Ala par chromatographie d’affinité.

L’absorbance à nm de l’éluât est représentée en bleu et le pourcentage en tampon d’élution est quant à lui représenté en vert.

A B

Comme de nombreuses purifications ont été menées en parallèle, nous avons choisi de ne recueillir que les fractions qui semblent pures lors de l’analyse par SDS-PAGE, c’est-à-dire sans contamination visible. En effet, la présence de protéines contaminantes nous obligerait à réaliser une seconde purification, par chromatographie d’exclusion de taille, ce qui nécessiterait beaucoup plus de temps. Les fractions les plus pures ont donc été regroupées, concentrées puis dialysées contre le tampon final (Tris HCl pH 7,5 50 mM, NaCl 50 mM). Après cette étape, la pureté des protéines est contrôlée par SDS-PAGE et DLS (Figure IV.59). En tout, douze mutants ont été

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purifiés en quantité suffisante pour permettre l’analyse de leurs propriétés enzymatiques et pour certaines des études structurales.

Figure IV.59 - Contrôle de la pureté des protéines mutantes de Zg-VIPO1. Exemple du contrôle de la pureté

par SDS-PAGE (A) des protéines Zg-VIPO1 WT (2), Tyr263Ala (3), His360Ala (4), Phe353His (5) et Ser358Ala (6) et par DLS (B) des protéines mutantes Tyr263Ala et Phe353His

B

Tyr263Ala

Phe353His

A