Mouvement des iMTOCs

Le but de cette expérience et de comprendre le type de liaison existant chez S.pombe entre la membrane nucléaire, les iMTOCs et les microtubules. Les microtubules de S.pombe contrôlent la forme de la cellule en définissant la position des zones de croissance cellulaire aux extrémités de la cellule. [Jacqueline Hayles 2001] Réciproquement, nous avons montré au cours d’une autre étude que la forme de la cellule contrôle l’organisation des microtubules. [Terenna 2008] Ainsi, une cellule courbée artificiellement développera un réseau asymétrique de microtubules. Cette expérience de courbure cellulaire a été réalisée à l’aide d’un dispositif microfluidique. En effet, la possibilité de piéger des cellules dans des microcanaux ayant une forme contrôlée permet de déformer les cellules. En injectant des levures S.pombe sauvages dans des canaux tordus, nous avons montré que les microtubules se rassemblent d’un seul coté de la cellule. En touchant la paroi cellulaire, les microtubules se tordent et s’accumulent dans la partie de la cellule leur permettant de conserver le plus grand rayon de courbure (Figure 5.24). Nous avons ainsi montré que la forme de la cellule a une influence sur la structure des microtubules.

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Figure 5.24 : Une cellule S.pombe de type sauvage dans un microcanal courbe. Au cours de sa croissance la cellule se courbe et les microtubules se réorganisent de manière asymétrique.

[Terrena 2008]

Les microtubules sont liés à l’enveloppe nucléaire de la cellule par des points de fixation appelés iMTOCs (Interphase Microtubule Organisation Center). [PT. Tran 2001] Les types de liaison existant entre les iMTOCs, le noyau et les microtubules ne sont pas connus à ce jour. Lorsqu’une levure S.pombe est maintenue en position courbe dans un canal microfluidique, les microtubules se rassemblent ce qui provoque un rassemblement des iMTOCs. La dépolymérisation des microtubules de ces cellules courbées à basse température provoque la libération de la contrainte appliquée par les microtubules sur les iMTOCs. L’étude du comportement des iMTOCs en l’absence de la contrainte appliquée par les microtubules nous permet de connaître le type d’interaction existant entre les IMTOC, le noyau et les microtubules. Si une interaction élastique lie les iMTOCs et le noyau, les iMTOCs devraient retrouver une configuration symétrique lors de la disparition des microtubules. Dans le cas contraire, les iMTOCs resteront dans une position asymétrique et les microtubules repousseront également de manière asymétrique. Il est ainsi possible d’observer le comportement des iMTOCs en présence ou en l’absence de la contrainte appliquée par les microtubules. Pour cela nous avons étudié la dynamique des iMTOCs d’une cellule courbée en utilisant des changements rapides de température pour contrôler la polymérisation des microtubules..

Dans les cellules courbées par croissance dans un microcanal, le phénomène de rassemblement des microtubules est statistique et toutes les cellules ne réagissent pas exactement de la même manière lorsqu’elles sont contraintes dans une forme courbée. Certaines conditions de taille de cellule et de courbure favorisent grandement les chances d’obtenir des cellules ayant la totalité de leurs microtubules dans la même partie de la cellule.

Pour obtenir des cellules ayant une taille optimale pour nos expériences, nous avons utilisé un mutant de S.pombe cdc25_atb2_GFP (Pt 72). Le gène cdc25 code pour une protéine nécessaire à l’entrée en phase de mitose. Le mutant thermosensible que nous utilisons a un gène cdc25 muté qui produit une protéine fonctionnelle à 22°C et inactive à 35°C. Ainsi à 35 °C ce mutant ne peut pas rentrer en mitose et continue à grandir indéfiniment. Il est ainsi possible de contrôler la taille de la cellule en choisissant le temps d’incubation de la cellule à 35°C. Pour cette expérience un module Peltier est réglé à 1°C et l’autre à 22°C.

Après 2 heures d’incubation à 35°C les cellules sélectionnées possédent une structure de microtubules fortement asymétrique (Figure 5.25).

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Figure 5.25 : Photo de S.pombe dans un canal courbé à température ambiante après deux heures d’incubation à 35°C.

Nous actionnons alors le pousse seringue à 30µL/s. pour faire baisser la température du dispositif. Les microtubules commencent à se dépolymériser et disparaissent presque complètement en moins de trois minutes. Nous faisons varier le débit en fonction du temps pour conserver des microtubules très courts et ainsi pouvoir observer leur mouvement dans la cellule (Figure 5.26).

Figure 5.26 : Photo de S.pombe dans un canal courbé à basse température. A basse température les microtubules partiellement dépolymérisées restent à la même position.

Apres 6 minutes et 30 seconde à basse température, nous inversons le sens du flux et le dispositif revient à température ambiante. Les microtubules réapparaissent en moins de trois minutes dans leur position initiale, de manière fortement asymétrique (Figure 5.27).

Figure 5.27 : Photo de S.pombe dans un canal courbé lors du retour à température ambiante.

Cette étude montre que les iMTOCs n’ont pas d’interaction élastique avec le noyau et ne retrouvent pas une position symétrique en l’absence de contrainte. Une fois que les iMTOCs ont été déplacés par les microtubules, ils conservent leurs nouvelles positions.

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Cette expérience requiert une repolymérisation des microtubules dans le sens du grand axe de la cellule. Dans le cas contraire le contact des microtubules avec la membrane cellulaire au dessus du noyau exerce une force suffisante sur les iMTOCs pour les déplacer. Ainsi, lors de leur repolymérisation, les microtubules perturberont la distribution des iMTOCs et rendront l’expérience ininterprétable. Nous pouvons visualiser ce phénomène sur la figure 5.28.

Figure 5.28 : Série de photographie montrant l’influence d’une microtubule touchant la paroi cellulaire sur la réorganisation du cytosquelette de S.pombe lors du retour à température

ambiante.

Dans cette expérience, un microtubule touche la membrane cellulaire située juste au dessus du noyau et décale ainsi une partie des IMTOC vers le centre de la cellule.(15min-16min) Une fois une partie des IMTOC déplacée, les microtubules repoussent de manière désorganisée dans la cellule. (20min-30min)