Os Gráficos 6, 7 e 8 mostram o efeito do RG 108 administrado por via intraperitoneal nas doses de 0,2 e 0,4 mg/kg comparados com o veículo (grupo controle), nas medidas de latência (s) para a primeira entrada no compartimento escuro, no tempo (%) de permanência no compartimento claro e no número de transições entre os compartimentos, respectivamente, no modelo de transição claro-escuro.
A ANOVA de uma via não mostrou (Gráfico 6) efeito significante do tratamento na latência para a primeira entrada [F(2,21) = 1,305; p > 0,05].
Como pode ser observado no Gráfico 7, a ANOVA de uma via mostrou aumento significante no tempo (%) de permanência no compartimento claro nas doses de 0,2 mg/kg [F(2,21) = 7,591; p < 0,05] e 0,4 mg/Kg [F(2,21) = 7,591; p < 0,01] quando comparado com o veículo, sugerindo assim efeito do tipo ansiolítico nas duas doses avaliadas nesse parâmetro.
A ANOVA mostrou também que o tratamento com RG 108 apresentou aumento no número de transições (Gráfico 8) na dose de 0,4 mg/kg [F(2,21) = 4,668; p < 0,05], sugerindo efeito do tipo ansiolítico apenas na maior dose nesse parâmetro.
A Tabela 4 mostra que a atividade locomotora dos animais no campo aberto não foi alterada pelo tratamento com RG 108 [F(2,21) = 0,533; p > 0,05].
Gráfico 6: Efeito da injeção intraperitoneal de RG 108 nas doses de 0,2 mg/kg (n=8), 0,4 mg/kg (n=8) ou veículo (n=8) sobre a latência (s) para a primeira entrada no compartimento escuro no modelo de transição claro-escuro. Os valores foram expressos pela média ± EPM (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).
Gráfico 7: Efeito da injeção intraperitoneal de RG 108 nas doses de 0,2 mg/kg (n=8), 0,4 mg/kg (n=8) ou veículo (n=8) sobre o tempo de permanência no compartimento claro no modelo de transição claro-escuro. Os valores foram expressos pela média ± EPM (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).
* p < 0,05 e * * p < 0,01 comparado ao grupo controle. 0 50 100 150 Veículo RG 108 0,2 RG 108 0,4 La tên cia (s) pa ra a pri mei ra en trada
*
**
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Veículo RG 108 0,2 RG 108 0,4 T empo ( % ) de pe rm an ên cia no co mpart imento clar oGráfico 8: Efeito da injeção intraperitoneal de RG 108 nas doses de 0,2 mg/kg (n=8), 0,4 mg/kg (n=8) ou veículo (n=8) sobre o número de transições entre os dois compartimentos no modelo de transição claro-escuro. Os valores foram expressos pela média ± EPM (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).
* p < 0,05 comparado ao grupo controle.
Tabela 4: Efeito da administração intraperitoneal de RG 108 nas doses de 0,2, 0,4 mg/kg ou veículo sobre o número de cruzamentos no campo aberto.
Tratamento Número de Cruzamentos a
Veículo 37,38 ± 6,19 RG 108 0,2 mg/kg 46 ± 8,01 RG 108 0,4 mg/kg 38,63 ± 4,45 Nota : a Dados representam média ± EPM.
*
0 5 10 15 Veículo RG 108 0,2 RG 108 0,4 N úmero de t rans içõ es5. DISCUSSÃO
No presente trabalho, investigamos a hipótese de que o tratamento agudo sistêmico com inibidores de DNA metiltransferase (5-Aza D ou RG 108) teria um efeito do tipo ansiolítico e/ou panicolítico em animais submetidos ao modelo do labirinto em T elevado e efeito do tipo ansiolítico no modelo de transição claro-escuro.
Cabe ressaltar, que ao nosso conhecimento, não existem estudos publicados na literatura que avaliem uma possível ação de drogas inibidoras da DNA metiltransferase na modulação de comportamentos aversivos relacionados à ansiedade em ratos.
Os resultados obtidos no presente estudo mostram que as drogas e doses utilizadas não alteraram a atividade locomotora dos animais medida no teste do campo aberto. Este dado indica que os efeitos observados, tanto no modelo do LTE, quanto no modelo de transição claro-escuro, não sejam devidos à ação inespecífica das drogas utilizadas sobre a atividade locomotora dos animais nesses modelos.
Ademais, diante dos nossos resultados no LTE com as duas drogas testadas, não foi observado efeito significante em relação à resposta de fuga, sugerindo que os inibidores da enzima DNA metiltransferase não afetam comportamentos relacionados ao transtorno de pânico.
É importante mencionar, que ambos os modelos utilizados em nossos experimentos, por se tratarem de modelos baseados em aversões inatas dos roedores, como altura, espaços abertos e iluminados (GRAEFF et al., 1994; PELLOW et al., 1985; LISTER et al., 1987) oferecem vantagens consideráveis em relação aos demais modelos experimentais de ansiedade existentes, pois não interferem em fatores como alimentação, privação de água, dor por choques elétricos, além de não necessitarem de treinamentos prévios (ONAIVI; MARTIN, 1989).
Inicialmente analisamos o efeito do tratamento agudo sistêmico com 5-Aza D no LTE (experimento 1) e os resultados mostram que a menor dose (0,2 mg/Kg) prejudicou a aquisição da esquiva inibitória dos braços abertos, sugerindo um efeito do tipo ansiolítico. Esses resultados estão de acordo com dados recentes de Sales e Joca ainda não publicados mostrando que inibidores de DNA metiltransferase induzem efeito ansiolítico em animais testados em outro modelo de ansiedade, o labirinto em cruz elevado. Além disso, estudos anteriores mostraram que o 5-Aza D foi capaz de
inibir a metilação do DNA no hipocampo de ratos, ativando genes ligados a processos de plasticidade neural, que estavam silenciados pela metilação (LEVENSON et al., 2006; SALES; JOCA, 2015; SALES et al., 2011).
Outro estudo no qual também foi utilizado o modelo do labirinto em cruz elevado para avaliar a ansiedade em ratos knockout para a isoforma DNMT1 mostrou efeito do tipo ansiolítico nesse teste, sugerindo que a enzima DNMT1 está claramente envolvida em processos ligados a ansiedade (MORRIS et al., 2016).
Em seguida, no experimento 2, investigamos o efeito do tratamento agudo sistêmico com 5-Aza D em outro modelo de ansiedade já padronizado em nosso laboratório, o teste de transição claro-escuro. Para tal, foi investigada se a administração intraperitoneal de 5-Aza D também apresentaria efeito do tipo ansiolítico no modelo. Os parâmetros utilizados neste estudo incluem a latência para a primeira entrada no compartimento escuro, o número de transições entre os compartimentos e o tempo de permanência (%) no compartimento claro. Neste sentido, estudos anteriores relatam que o tempo gasto em cada compartimento tem sido referido como um reflexo de aversão (BELZUNG et al., 1987) e o número de transições como um índice de atividade exploratória (CRAWLEY; GOODWIN, 1980; COSTALL et al., 1989a, 1989b). Já a latência para a primeira entrada no compartimento escuro está envolvida com a inibição do animal (HASCOËT; BOURIN, 1998).
Em relação à latência para a primeira entrada no compartimento escuro, nossos resultados não mostraram efeito significante dos tratamentos utilizados. Do mesmo modo, dados não publicados do nosso laboratório (SOUZA, 2016) também não encontraram efeitos significantes neste parâmetro da noradrenalina administrada na substância cinzenta periaquedutal dorsal.
Na mesma direção, Grivas e colaboradores (2013) não observaram efeito significante na latência para a primeira entrada no compartimento escuro ao administrarem sistemicamente o LY379268, um agonista seletivo para um subtipo de receptor de glutamato. No entanto, foi observado efeito do tipo ansiogênico no tempo de permanência no compartimento claro e no número de transições entre os compartimentos.
Por outro lado, Young e Johnson (1991) observaram efeito significante na latência para a primeira entrada no compartimento escuro ao testarem um agonista de receptor 5-HT1A (8-OH-DPAT) administrado sistemicamente, sem alteração na atividade locomotora.
Embora existam dados na literatura sobre o tempo de latência para a primeira entrada, os autores pouco discutem sobre este parâmetro. No entanto, duas hipóteses são consideradas: o aumento do tempo de latência pode ser resultado de um comportamento desinibido e atenuação da ansiedade, onde os animais passam mais tempo explorando a área iluminada, e a outra seria a influência da sedação, onde os animais não conseguem se mover rapidamente para o compartimento escuro (HASCOËT; BOURIN, 1998).
Ainda em relação ao experimento 1, nossos resultados mostraram aumento significante no tempo de permanência (%) dos animais no compartimento claro, assim como no número de transições entre os compartimentos claro e escuro dos animais tratados com 5-Aza D nas doses de 0,2 e 0,4 mg/kg se comparado ao grupo controle, sugerindo efeito do tipo ansiolítico.
Assim como nos demais experimentos, não houve alteração na atividade locomotora em nenhuma das doses testadas. Este dado indica que o efeito do tipo ansiolítico do 5-Aza D não está relacionado à ação inespecífica da droga sobre a atividade locomotora dos animais.
Esses resultados no teste de transição claro-escuro reforçam o possível efeito do tipo ansiolítico de 5-Aza D já encontrado no LTE.
Posteriormente, com o objetivo de avaliar o efeito de outro inibidor de DNA metiltransferase sobre comportamentos relacionados à ansiedade, investigamos se o tratamento com RG 108, um inibidor não nucleosídeo da DNA metiltransferase nas doses de 0,2 e 0,4 mg/kg, apresentaria efeito sobre as respostas de esquiva inibitória e fuga no LTE (Experimento 3) e nos parâmetros avaliados no teste de transição claro-escuro (Experimento 4).
Nossos resultados (Experimento 3) mostram que a administração intraperitoneal de RG 108 nas doses utilizadas no presente estudo não apresentou efeito nas respostas de esquiva inibitória e fuga no labirinto em T elevado. As razões para essa variabilidade nos resultados entre as drogas 5-Aza D e RG 108 testadas no LTE não são claras, porém uma possibilidade seria o fato das duas drogas apresentarem mecanismos de ação distintos: o 5-Aza D precisa ser incorporado ao DNA para inibir a ligação da DNA metiltransferase ao anel de citosina, já o RG 108 é capaz de inibir a DNMT do DNA livre, além de ser específico para a isoforma DNMT1 (ASGATAY et al., 2014), a DNMT mais abundante em células somáticas (ROBERTSON et al., 1999).
No experimento 4, foi observado que não houve efeito significante do tratamento com RG 108 na latência para a primeira entrada no teste de transição claro-escuro. Porém, houve aumento no tempo de permanência (%) no compartimento claro nas duas doses testadas e aumento significante no número de transições na dose de 0,4 mg/kg se comparada ao grupo que foi tratado com veículo, sugerindo efeito do tipo ansiolítico. Cabe mencionar, que apesar das inúmeras variações no que se refere à latência para a primeira entrada na literatura, preferimos utilizá-la como parâmetro, pois em adição com os demais parâmetros avaliados é possível aumentar a sensibilidade geral do modelo (KILFOIL et al., 1989).
Ademais, estudos anteriores sugerem que o tempo gasto na área iluminada e o número de transições parecem ser os parâmetros mais genuínos para avaliar a atividade do tipo ansiolítica no modelo de transição claro-escuro (COSTALL et al., 1989; HASCOËT; BOURIN, 1998; KILFOIL et al., 1989; ONAIVI et al., 1989; YOUNG et al., 1990).
Em estudo recente realizado por Sales e Joca (2015) foi analisada a taxa de metilação do DNA no córtex pré-frontal e hipocampo de grupos independentes de ratos trinta minutos após serem submetidos à administração sistêmica de RG 108 na dose de 0,4 mg/Kg e ao nado forçado. Os resultados mostraram que o estresse aumentou os níveis de metilação do DNA nas áreas encefálicas analisadas e que o RG 108 atenuou a metilação. Isso mostra a capacidade do RG 108 de inibir a metilação do DNA no sistema nervoso central de ratos.
Na mesma direção, Murphy e colaboradores em um estudo publicado em 2015, observaram um aumento global da metilação do DNA em pacientes ansiosos e mostraram uma correlação positiva entre a expressão das DNMTs e o nível de ansiedade (MURPHY et al., 2015).
Além disso, as razões para a variabilidade nos resultados entre as drogas nos dois modelos utilizados não são claras, porém uma possibilidade seria as diferenças entre funções motoras, comportamento emocional ou manipulações experimentais sobre os diferentes grupos de animais, como sugerido em um estudo publicado por Staay et al. (2009), enfatizando a necessidade da utilização de múltiplos testes comportamentais para exclusão desses fatores.
Em conjunto, os resultados do presente trabalho mostram que a redução da metilação do DNA, por meio de tratamento farmacológico com inibidores da enzima DNA metiltranferase (5-Aza D e RG 108), induziu efeito do tipo ansiolítico em dois
modelos animais de ansiedade. No entanto, são necessários estudos adicionais para delinear o mecanismo de ação do efeito ansiolítico destes inibidores, correlacionando com a possível redução da metilação global de DNA em áreas encefálicas importantes na neurobiologia dos transtornos de ansiedade estudados.
6 CONCLUSÃO
• 5-Aza D na dose de 0,2 mg/kg reduziu a latência da esquiva 1, no labirinto em T elevado, em comparação com o grupo controle, aumentou o tempo (%) de permanência dos animais no compartimento claro e o número de transições no modelo de transição claro-escuro, sugerindo um efeito do tipo ansiolítico.
• 5-Aza D na dose de 0,4 mg/kg mostrou aumento significante no tempo (%) de permanência dos animais no compartimento claro e no número de transições no modelo de transição claro-escuro, sugerindo um efeito do tipo ansiolítico.
• RG 108 não apresentou efeito significante nas doses testadas sobre as respostas de esquiva inibitória e fuga no labirinto em T elevado.
• RG 108 na dose de 0,2 mg/kg aumentou o tempo (%) de permanência dos animais no compartimento claro comparado ao grupo controle, sugerindo um efeito do tipo ansiolítico.
• RG 108 na dose de 0,4 mg/kg aumentou o tempo (%) de permanência dos animais no compartimento claro e o número de transições no modelo de transição claro-escuro, sugerindo um efeito do tipo ansiolítico.
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