Chez les HUVECs, les données obtenues par RT-qPCR, marquage à la Con A et spectrométrie de masse ont permis de mettre en évidence trois phénomènes en partie interdépendants dans la synthèse des N-glycanes.
I.A.1. Augmentation des N-glycanes oligomannose
Suite à l’irradiation, on remarque une augmentation des motifs N-glycaniques hautement mannosylés et hybrides. Comme l’atteste par le marquage Con A (article figure 1). Les données de spectrométrie de masse confirment une augmentation des motifs hautement mannosylés significative à partir de 7 jours post-irradiation (article figure 2). Cette augmentation est en accord avec les données de RT-qPCR montrant une diminution de l’expression du gène Man1c1 qui code
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pour une mannosidase I (article figure 6 + figure supplémentaire 8). En effet, une diminution des mannosidases I ralentit le trimming des N-glycanes et empêche la transformation des structures hautement mannosylées en structures hybrides puis complexes. Les données de RT-qPCR et de spectrométrie de masse ne permettent pas en revanche d’en apprendre plus sur l’influence de l’irradiation sur les structures hybrides. On observe uniquement une diminution de l’expression du gène B4galt5 qui code pour une enzyme permettant l’allongement de la première antenne. En revanche, les données de spectrométrie ne valident la présence d’aucune structure hybride. Il est probable que la plupart des N-glycanes hybrides soient rapidement transformés en N-glycanes complexes.
L’irradiation provoque une augmentation de la N-glycosylation de type hautement mannosylé. Ce phénomène, jamais décrit après irradiation, présente des similitudes avec les données de la littérature dans un contexte inflammatoire aiguë et chronique. En effet, une exposition des HUVECs au TNF-α pendant 4 ou 24 h provoque une augmentation membranaire de la quantité ou de la proportion de N-glycanes hautement mannosylés212,236. Ce phénomène a aussi été identifié en contexte tumoral287. L’augmentation de la N-glycosylation est également retrouvée en contexte inflammatoire chronique chez des HAECs soumises à un stress oscillatoire pro-athérogène, mais aussi in vivo dans les lésions athérosclérotiques chez des souris ApoE-/- et sur des artères coronariennes humaines230. L’augmentation des motifs hautement mannosylés semble avoir pour origine une diminution de l’expression des gènes codant pour des mannosidases I. En effet, une diminution de l’activité des mannosidases I et/ou une baisse de l’expression de leurs gènes sont constatées en contexte inflammatoire 230,236, et notamment dans les artères de rats diabétiques375.
I.A.2. Effets sur le catabolisme des N-glycanes
La dégradation des N-glycanes pourrait être augmentée après irradiation. En effet, l’analyse transcriptomique met en évidence l’augmentation significative de Gnptab et Fuca1. Ces gènes codent pour des enzymes impliquées dans l’orientation et la dégradation des N-glycanes vers le lysosome. GNPTAB est une sous-unité du complexe GlcNAc-1-phosphotransférase, responsable de la phosphorylation des mannoses et de l’adressage des N-glycanes au lysosome via la voie des mannose-6-phosphates241,376. FUCA1 est responsable de la dégradation lysosomale des groupements fucosylés liés aux N- ou aux O-glycanes (article figure supplémentaire 8). Son augmentation, sans être spécifique des N-glycanes, est liée à une activité lysosomale plus importante. En plus du ralentissement de la chaine de synthèse, une partie des N-glycanes pourrait donc être dégradée. L’augmentation de la dégradation lysosomale pourrait être le reflet d’un stress du Golgi. En effet, les RI ont directement été reliés au stress Golgien et à une surexpression membranaire du marquage Con A377. De même, les lésions radio-induites à l’ADN conduisent à une réorganisation Golgienne.
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Cette réorganisation passe par l’activation de la voie DNA-PK en jeu dans la réparation de dommages radio-induits à l’ADN378.
I.A.3. Modification du branchement et diminution des complexes
L’irradiation provoque une importante modification de l’expression des gènes codant pour les enzymes responsables de la création des antennes : l’expression de Mgat4a est diminuée, tandis que celles de Mgat4c et Mgat5b sont augmentées. Cependant, les N-glycanes complexes marqués par les lectines PHA-L et UEA-1 (article figure 3) et identifiés par spectrométrie de masse (article figure 2) sont diminués après irradiation. La PHA-L reconnaît spécifiquement les antennes β1-2 et β1-6 pourvues d’un galactose en β4 sur la branche α6Man des N-glycanes. Quant à UEA-1, elle identifie indifféremment les fucoses des antennes des mannoses α3 ou α6. D’une part, l’antenne β1-6 est susceptible d’être augmentée suite à la surexpression de Mgat5b. D’autre part, aucune diminution de Mgat1, qui code pour une enzyme qui permet l’ajout de l’antenne β1-2, n’a été constatée. On aurait donc pu s’attendre une augmentation du marquage PHA-L. Aucun gène des enzymes de fucosylation n’est différentiellement exprimé, alors que le marquage UEA-1 diminue. De plus, l’augmentation de Mgat4c prédispose elle aussi à la création de structures complexes.
Deux mécanismes peuvent être avancés pour expliquer la diminution des motifs complexes. Premièrement, la chaine de synthèse des N-glycanes est un processus en série. Nous avons vu que les enzymes responsables du trimming sont potentiellement diminuées, et que les glycanes oligomannosidiques sont augmentés. On peut penser que la chaine de synthèse reste bloquée dans les premières étapes. Le blocage de la synthèse en amont, combinée à une potentielle augmentation de la dégradation, diminuerait les substrats disponibles pour la synthèse des N-glycanes complexes en aval. L’augmentation des N-glycanes hautement mannosylés aurait donc lieu au détriment de la synthèse des glycanes complexes. Deuxièmement, la variabilité importante des niveaux d’expression des GlcNAc-transférases est connue pour avoir des conséquences sur la poursuite de la chaine de synthèse224,229. En effet, le N-glycane bi-antenné obtenu après l’étape 14 (Figure 30) est au cœur d’une compétition importante entre les GlcNAc-transférases. L’ajout de l’antenne β4 sur le α3Man pourra être modulé par la transcription contradictoire des Mgat4a (augmentée) et Mgat4c (diminuée). Cependant, il semble que cette étape soit dominée par l’action de Mgat4a dont la diminution pourrait être déterminante379,380. Les antennes β1-4 et β1-6 sur le α6Man sont probablement augmentées suite à la surexpression de Mgat4c et Mgat5b, respectivement. Il ne semble pas y avoir de modification de l’expression de Mgat3, dont l’enzyme catalyse l’ajout d’une antenne sur le mannose central appelé bisecting GlcNAc, et peut bloquer l’ajout des autres branches (voir partieIII.A.2.a.i Synthèse des N-glycanes).
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Les N-glycanes complexes semblent sous-exprimés, cependant les gènes codant pour la création des antennes sont modulés par l’irradiation. La multiplication des branches est un facteur important dans la régulation des taux membranaires des glycoprotéines. Plus le branchement est important, plus les interactions extracellulaires, notamment avec les galectines, et l’expression membranaire sont prolongées. Le nombre de N-glycanes sur la protéine conditionne aussi son expression et sa dépendance vis-à-vis de la voie des hexosamines381. La diminution de l’antennation, notamment celle ajoutée par la MGAT5, induit des phénomènes pro-inflammatoires353,382. Cette diminution est impliquée dans l’auto-immunité des lymphocytes T dans la sclérose en plaque235,383,384. Dans les leucocytes, l’activation du TCR dépend du branchement via MGAT5. La perte du branchement déclenche une hypersensibilité immune, reliée à des mécanismes auto-immuns 200. A l’inverse, l’augmentation du branchement et la diminution des structures oligomannosidiques ont un effet protecteur vis à vis de l’inflammation et des phénomènes auto-immun235,353,385. L’augmentation des antennes a pu être observée chez les HUVECs et dans une lignée immortalisée de cellules microvasculaires en réponse au TNF-a285
. D’autre part, cette antennation est retrouvée sur les cellules cancéreuses et notamment métastatiques386–390. Dans ce cas, l’antennation semble être un mécanisme important utilisé par les cellules cancéreuses dans la croissance et pour échapper aux cellules immunitaires200,391.
Nos résultats montrent clairement que l’irradiation provoque un changement de la N-glycosylation endothéliale (article figures 1-3). Cette modification du N-glycome présente des points de ressemblance avec les phénotypes observés chez les CE en contexte inflammatoire. En condition physiologique, la plupart des N-glycanes présentent une structure complexe, ce qui participe à leur maintien membranaire par interaction avec les galectines230,231. A l’inverse, la dysfonction de la synthèse des N-glycanes mène à de nombreuses pathologies de nature auto-immune353,361,383,392. Dans notre étude, ces changements pourraient être dus à un déséquilibre de synthèse. Les N-glycanes de type oligomannose seraient préférentiellement synthétisés, et le branchement pourrait être modifié. Ces deux phénomènes sont clairement impliqués dans des phénomènes inflammatoires et auto-immuns. Ils pourraient influencer le recrutement des cellules circulantes.