Le glycome est un ensemble de structures saccharidiques dont la régulation de la synthèse est complexe. Les motifs glycaniques conditionnent et modifient la fonctionnalité des protéines. Ils participent ainsi à l’établissement des fonctions cellulaires et sont notamment impliquées dans les processus d’adhésion et de communication. L’endothélium vasculaire est le siège de nombreuses interactions avec les cellules circulantes. Or, ces interactions sont en partie gouvernées par le glycome. Nous dresserons dans cette partie un tableau du glycome endothélial et verrons comment, il participe aux fonctions endothéliales en condition physiologique.
III.C.1. Une glycosylation différentielle des lits vasculaires
Plusieurs études chez différentes espèces se sont intéressées à la caractérisation de la glycosylation des lits vasculaires. La plupart d’entre elles ont utilisé des lectines d’origine végétale. Une observation des différents lits vasculaires du Myxine glutinosa a été effectuée en microscopie
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électronique avec un jeu de 9 lectines. D’un point de vue évolutif, ce vertébré marin est proche de l’ancêtre commun des Vertébrés. Cette étude attire l’attention sur l’hétérogénéité phénotypique des lits vasculaires notamment du point de vue glycanique248. Cette hétérogénéité pourrait être conservée au cours des processus évolutifs. Chez le rat, des marquages endothéliaux ont également démontré une hétérogénéité. La lectine GS-1, connue jusqu’à lors pour marquer l’ensemble des lits vasculaires, a démontré une hétérogénéité de marquage249. Dans des études menées chez des embryons de poulet, la LCA et la Con A marquant les N-glycanes de type oligomannosidique, et la WGA marquant les GlcNAc, ont été utilisées pour marquer les endothéliums au cours du développement embryonnaire. Si les 3 lectines permettent de marquer l’endothélium dans les premiers stades, seul le marquage LCA est maintenu dans les stades plus tardifs. Cette étude montre encore une fois des différences de glycosylation entre les différents endothéliums250. Dans l’ensemble, ces résultats montrent que la glycosylation des lits vasculaires constitue une signature spécifique à chaque endothélium. Le glycome ajoute une différence phénotypique supplémentaire entre les différents endothéliums251.
III.C.2. Caractérisation du glycome de l’endothélium en condition basale
III.C.2.a. Vasculogenèse
Les CE vasculaires, comme beaucoup d’autres types cellulaires, expriment à leur surface des glycoprotéines N- et O-glycosylées. Elles expriment fortement les motifs O-glycaniques qui participent à l’angiogenèse, à la différenciation entre réseaux lymphatiques et vasculaires, et au maintien de l’intégrité vasculaire. Cependant, le rôle des O-glycanes dans l’établissement de ces fonctions reste aujourd’hui mal compris. La perte des O-glycanes et notamment des cores 1 et 2 chez la souris se traduit au stade embryonnaire par des hémorragies cérébrales. La perte des O-glycanes perturbe les interactions intercellulaires entre les CE et entre les CE et avec les cellules de soutien. Les O-glycanes sont donc indispensables au maintien de l’intégrité vasculaire 252,253. Dans le système lymphatique, le rôle des O-glycanes est déterminant. La O-glycosylation de la podoplanine est indispensable à la séparation en vaisseaux vasculaires ou lymphatiques253.Elle est aussi nécessaire au maintien de l’intégrité des ganglions lymphatiques254. La synthèse des HS participe aussi à la vasculogenèse, en contribuant au glyco-environnement endothélial255.
III.C.2.b. Endothélium physiologique
Les études sur la glycosylation de l’endothélium vasculaire en condition basale sont peu nombreuses. D’une part, la glycosylation des CE est peu étudiée, (alors que celle des leucocytes l’est beaucoup plus). D’autre part, la plupart des études se concentrent sur des processus pathologiques et apportent peu d’information sur la glycosylation basale de l’endothélium.
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Dans une étude menée en 2006, le profil transcriptomique des gènes de glycosylation en condition basale et inflammatoire chez des EC humaines (HUVECs et FMVEC) a été établi. Les motifs glycaniques membranaires ont été quantifiés par marquages avec des lectines et ont montré une concordance avec l’expression des gènes. Au terme de cette étude, les auteurs confirment que le profil de glycosylation diffère en fonction de l’origine des différents lits vasculaires chez l’Humain. En effet, l’expression des gènes de glycosylation et les marquages lectiniques diffèrent entre les deux lignées. La corrélation entre les motifs membranaires observés par marquage lectinique et les gènes de glycosylation exprimés permet aux auteurs d’affirmer que les études transcriptomiques ciblées sur les gènes de glycosylation constituent une signature de la machinerie de glycosylation. Nous verrons dans la partie IV comment le stimulus inflammatoire module l’expression de la machinerie de glycosylation.
En 2010, une étude plus approfondie s’est intéressée à l’expression de 432 gènes de glycosylation sur un modèle de CE microvasculaire (HBMEC-60). En condition basale c’est l’expression des gènes de glycosylation codant pour les glycosyltransférases qui est la plus élevé. C’est particulièrement vrai pour les gènes codants dans la synthèse des N-glycanes, qui sont connus pour leur expression ubiquitaire. On remarque notamment une forte expression de DDOST, DAD1 et RPN1, 3 gènes codants pour des acteurs du complexe OST, indispensable à la synthèse des N-glycanes. Le gène DMP3 a lui aussi une expression basale élevée. Ce gène code pour une sous-unité stabilisatrice du complexe dolichol-phosphate mannosyltransférase, indispensable à la création des glycoprotéines à ancre GPI. La synthèse basale des GAGs est elle aussi élevée, comme le reflètent les gènes XYLT2 et ß4GALT7 dans la synthèse des CS et EXT1 dans celle des HS. Les gènes codant pour le transport des sucres et leur synthèse présentent aussi une expression élevée. Les gènes codants pour le catabolisme des glycanes représentent le deuxième groupe fonctionnel le plus exprimé en condition basale. Enfin, le groupe des protéines liant des glycanes comme PECAM-1, ICAM-2 et les galectines est le moins exprimé en condition basale. Le profil établi dans cette étude montre de nombreuses ressemblances avec l’étude de 2006 précédemment évoquée, notamment sur l’expression des N-glycanes.
III.C.3. Le glycocalyx
Le glycocalyx endothélial est un réseau de protéoglycanes et de glycoprotéines lié à la membrane des
CE (Figure 23). Il recouvre la surface luminale des CE et constitue une sorte de gel jouant le rôle de
barrière entre les CE et le sang. Il intègre dans ses mailles des molécules solubles d’origine plasmatique et endothéliale. Cette structure apparaît depuis quelque temps comme un acteur majeur de la physiologie et la physiopathologie vasculaire. Il est notamment impliqué dans les phénomènes de mécanotransduction, homéostasie, signalisation et interaction entre les cellules
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sanguines et la paroi vasculaire. Son rôle dans des affections comme le diabète, l’ischémie-reperfusion et l’athérosclérose est également étudié. L’ensemble de la littérature s’accorde sur le rôle vasculoprotecteur du glycocalyx. Cependant, sa caractérisation et sa visualisation sont rendues difficiles du fait de la fragilité de cette structure256. Ainsi, les études s’accordent difficilement sur son épaisseur. On sait cependant qu’elle dépend du type (artériel ou veineux) et de la section des vaisseaux. Son épaisseur augmente proportionnellement avec la section du vaisseau257 . Chez la souris, il est ainsi d’une épaisseur de 2-3 µm dans les artères de faible section258, et d’environ 4,5 µm dans les artères carotides259. Dans les veinules, son épaisseur est d’environ 0,4 µm260. On sait également que cette structure est bien moins développée in vitro qu’in vivo. Chez les HUVECs par exemple, son épaisseur dans la lumière du vaisseau est d’environ 0,52 µm in vivo, quand elle est seulement de 0,02 à 0,03 µm in vitro261.
III.C.3.a. Structure et composition
Le glycocalyx est connecté à la membrane des CE via de nombreuses molécules liées à la membrane endothéliale. Elles sont sa base structurale, souvent décrites comme sa colonne vertébrale ou sa charpente257. Les protéoglycanes représentent la principale colonne vertébrale du glycocalyx. Dans les tissus vasculaires, les protéoglycanes portant comme GAGs des HS représentent entre 50 et 90 % des protéoglycanes256. Mais cette proportion reste variable car l’expression des protéoglycanes par les CE est sensible à de multiples stimuli. La deuxième classe de GAGs les plus représentés sont les CS et DS. On retient généralement que le rapport entre HS et CS/DS est de 4 pour 1262. La proportion des KS dans les vaisseaux est moins bien documentée mais elle reste minoritaire comparée à celle des HS et CS/DS. Les protéoglycanes entrant dans la composition du glycocalyx sont notamment des syndécans et des glypicans. Du coté cytoplasmique, les syndécans sont liés au cytosquelette et participent à son organisation à travers la tubuline, la dynamine et l’α-actine263. Seul le glypican-1 est retrouvé à la surfaces des CE264. Il est exclusivement substitués par des HS265 et est localisé dans les radeaux lipidiques de la membrane des CE. Les biglycans sont les protéoglycanes porteurs de CS les plus représentés du glycocalyx216. A la différence des autres GAGs, l’HA est libre et non sulfatée. Sa charge négative est apportée par ses groupes carboxyliques, ce qui lui confère des propriétés hydratantes. Au sein du glycocalyx, il tisse des liens avec les protéines transmembranaires comme CD44 (HCAM)257.. Les conditions favorables à la diminution de l’épaisseur du glycocalyx, à la modification de la sulfatation et/ou d’épimérisation de ses GAGs ou encore à la modification de sa polarité sont autant de facteurs qui influencent la perméabilité vasculaire et modifient la liaison des protéines solubles et leur activité257.
Certaines glycoprotéines endothéliales lient le glycocalyx à la membrane. Elles sont elles aussi très sensibles aux stimuli endothéliaux. Les 3 grandes familles de molécules d’adhésion présentes dans le
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glycocalyx sont : les intégrines, les sélectines et les CAM de type Ig-like. En plus des molécules d’adhésion, le glycocalyx intègre des glycoprotéines impliquées dans la coagulation, la fibrinolyse et l’hémostase. La sialylation des glycoprotéines est un paramètre important : elle influence la charge négative du glycocalyx, à travers l’ionisation de l’acide sialique à pH physiologique266.
Enfin, des molécules solubles sont également intégrées dans les couches les plus luminales du glycocalyx. Il s’agit principalement de protéines et de protéoglycanes solubles. Le glycocalyx contient ainsi un grand volume de plasma non circulant, estimé entre 1 et 1,7 litre chez l’Homme267. Les molécules solubles sont apportées par le flux sanguin d’une part, et par l’endothélium d’autre part. A la surface luminale, il est riche en composés solubles d’origine plasmatique. Ces composées sont soit liés entre eux ou bien liés à des protéoglycanes solubles ou des sialoprotéines257,268. L’albumine et l’orosomucoïde, une glycoprotéine acide de la famille des globulines, proviennent toutes deux du flux sanguin. Leur intégration dans le maillage confère au glycocalyx sa polarité négative. Elles constituent des éléments déterminants dans le maintien d’une perméabilité sélective du glycocalyx. Le vWF quant à lui est un bon exemple de facteur soluble d’origine endothéliale, il s’intègre dans le maillage du glycocalyx. La charge négative du glycocalyx influence les interactions avec les constituants du plasma et les cellules circulantes. Elle prévient également la thrombose microvasculaire et maintient les propriétés rhéologiques269. Les composants solubles contribuent grandement aux aspects fonctionnels. Cependant, leurs participations aux aspects structurels sont moins connues, car plus ardues à démontrer.
En condition physiologique normale, la structure du glycocalyx est stable et sa composition relève d’un équilibre dynamique entre la biosynthèse continue de nouveaux glycanes provenant des CE, l’intégration de composés solubles d’origine endothéliale ou plasmatique et les altérations dépendantes du flux sanguin. Cet équilibre est indispensable au maintien de l’intégrité du glycocalyx268,270. Cet échange se traduit par une modification continue de l’épaisseur et de la composition du glycocalyx257.
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Figure 23 : structure du glycocalyx (d’après Weinbaum et al. 266).
SA : acide sialique ; CS : chondroïtine sulfate ; HS : héparane sulfate ; HA : acide hyaluronique.
III.C.3.b. Fonctions
Les fonctions du glycocalyx sont variées. La récente revue de Schött et al.268 en dresse la liste suivante:
Forme une interface entre la paroi vasculaire et le flux sanguin. Maintient le gradient colloïde osmotique de la barrière vasculaire. Agit comme une barrière envers :
o l’eau et les composés solubles d’origine vasculaire, o l’adhésion des leucocytes.
Agit comme un tamis pour les protéines plasmatiques,
Agit comme un site de liaison pour de nombreuses molécules comme (liste non exhaustive) : l’antithrombine III, le tissue factor pathway inhibitor, la lipoprotéine lipase, le VEGF, le FGF, la SOD extracellulaire, les molécules d’HA.
Agit comme un détecteur du stress de cisaillement et un régulateur de la mécanotransduction.
Trois grandes fonctions de l’endothélium retiennent en général l’attention : la modulation de la perméabilité, la mécanotransduction et la réponse inflammatoire.
III.C.3.b.i. Perméabilité & adhésion
En raison de sa charge négative, le glycocalyx joue un rôle dans la régulation de la perméabilité vasculaire et l’équilibre osmotique entre les CE et le sang271. En effet, l’encombrement stérique créé par son maillage d’une part, et sa charge d’autre part, permettent un filtrage sélectif des molécules pouvant atteindre et traverser l’endothélium257,272,273. La rupture du glycocalyx peut mener à une perte de la fonction de barrière avec pour conséquence la formation d’un œdème. De plus, la polarité négative du glycocalyx, présente en condition physiologique, évite l’interaction entre CE et érythrocytes. Par contre, la prévention des interactions avec les plaquettes et leucocytes semble
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plutôt due au rôle de barrière physique257,274. En effet, l’épaisseur normale du glycocalyx, de l’ordre de 0,5 µm, est bien plus importante que la longueur des molécules d’adhésion ICAM-1, VCAM-1, E- et P-sélectines. De ce fait, le glycocalyx, en les masquant évite les interactions CE-cellules circulantes270. Pour cette raison, l’interaction des leucocytes avec la membrane des CE est conditionnée au « rabotage » du glycocalyx. La perte d’épaisseur du glycocalyx, caractéristique notamment des phénomènes inflammatoires, est désignée sous le terme de « shedding »: elle semble indispensable à l’adhésion des leucocytes sur les CE274,275.
III.C.3.b.ii. Mécanotransduction :
De nombreux travaux ont démontré l’importance du glycocalyx dans la mécano-transduction276. Le glycocalyx transduit les signaux biochimiques et mécaniques externes en signaux biochimiques intracellulaires. Ce phénomène de mécanotransduction explique comment des modifications hémodynamiques induisent des changements conformationnels qui influencent la réponse cellulaire. Une des conséquences de la mécanotransduction est la surexpression d’eNOS qui induit une production plus importante de NO avec des effets relaxant sur le tonus vasculaire257,277. Ce phénomène de mécanotransduction fait intervenir tous les éléments qui composent le glycocalyx271.
III.C.3.b.iii. Maintien de l’hémostase et rôle dans l’inflammation
On note aussi l’importance du glycocalyx dans la protection des CE vis-à-vis des dommages engendrés par les nombreux médiateurs du stress oxydant. En condition physiologique, la SOD extracellulaire (eSOD) est liée aux HS. Cette enzyme permet la réduction du stress oxydant par chélation des radicaux libres et le maintien du NO bio disponible, ce qui participe à l’effet vasoprotecteur du glycocalyx257,278,279. Le glycocalyx jouerait également un rôle dans la régulation de la coagulation. En effet, de nombreux acteurs des voies de coagulation comme l’antithrombine III, le cofacteur II de l’héparine, la thrombomoduline et l’inhibiteur de la voie du TF font partie des molécules solubles du glycocalyx. Enfin, le glycocalyx peut lier des cytokines. D’une part, cela influence la synthèse de ses éléments structuraux ; d’autre part, leur fixation empêche le contact avec les récepteurs endothéliaux et module l’inflammation. Dans la partieIV consacrée au glycome endothélial en contexte inflammatoire, nous verrons le rôle joué par le glycocalyx dans l’inflammation.
Nous avons défini le glycome et détaillé son implication dans la physiologie endothéliale. Les RI induisent sur l’endothélium un stress important et un état pro-inflammatoire et pro-thrombotique. L’inflammation provoque des modifications glycaniques de l’endothélium vasculaire. Il est donc probable que ce soit aussi le cas des CE irradiées.
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