II.A.1. Motifs hautement mannosylés
L’irradiation provoque entre autre, la surexpression des molécules d’adhésion responsables de l’augmentation du recrutement des CE et des thrombocytes112,159,160,162,164,170,173,183,460. Justement, la glycosylation est une composante clé de la reconnaissance leucocyte–CE. Nous avons pu mettre en évidence une augmentation significative des N-glycanes hautement mannosylés après irradiation. Dans les phénomènes inflammatoires in vitro et in vivo, la surexpression des motifs hautement mannosylés est responsable d’une augmentation de l’adhésion des leucocytes sur les CE230,236,251,333. Nous avons montré que la modification de la N-glycosylation radio-induite avait des effets comparables.
Deux tests d’adhésion de monocytes sur un tapis de CE ont été utilisés : le premier en condition statique et le second en condition dynamique. Le test en condition statique (résultats non montrés) a permis d’observer une augmentation de l’adhésion des leucocytes sur le tapis irradié, comme décrit dans la littérature461. Mais nous n’avons pas mis en évidence une différence d’adhésion dépendante de la glycosylation. Ce résultat n’est pas surprenant : en effet, les travaux sur l’adhésion en contexte inflammatoire n’ont pas non plus montré de différence d’adhésion dépendante de la glycosylation en condition statique236.
En condition dynamique sous un flux laminaire (article figure supplémentaire 6), nous avons montré une différence significative de l’adhésion dépendante des motifs hautement mannosylés. En effet, la présence d’α-méthylmannose (un inhibiteur compétitif des motifs hautement mannosylés), rétablit en partie l’adhésion basale des cellules THP-1 sur le tapis d’HUVECs (article figure 5). Il est établit que l’irradiation provoque une surexpression des sélectines et des CAM (ICAM-1, VCAM-1 et PECAM-1). On pourrait penser que l’expression augmentée de ces glycoprotéines explique l’augmentation des motifs hautement mannosylés. Cependant, il a été démontré que la modification de la N-glycosylation est indépendante de l’expression des molécules d’adhésion dans un contexte pro-inflammatoire230,236. Il serait intéressant de le vérifier dans notre analyse. D’autre part, notre expérience avec l’α-méthylmannose prouve bien que c’est le changement de glycosylation qui induit une augmentation de l’adhésion et pas seulement l’augmentation des CAM ou des sélectines.
Le flux laminaire utilisé lors de cette expérience privilégie les interactions médiées par les CAM (on a vu dans l’Etat de l’Art partie II.A.3.d que les interactions avec les sélectines sont sensibles au catch bound et sont favorisées en flux turbulent). On peut donc penser que des glycanes hautement
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mannosylés sont portés par les CAMs. La VCAM-1 est N-glycosylée et exprime en contexte tumoral plusieurs glycoformes 462, ce qui soutient l’idée que sa glycosylation peut être modulée après irradiation. En contexte inflammatoire, VCAM-1 est proposée comme candidat potentiel pour porter les motifs hautement mannosylés responsables d’une augmentation de l’adhésion des monocytes230. Chez les HUVECs exposées au TNF-α, la part des ICAM-1 portant des motifs hautement mannosylés (forme HM-ICAM-1) est augmentée. La forme HM-ICAM-1 a aussi été identifiée in vivo sur les artères coronariennes humaines. Cette forme a été reliée à une augmentation de l’adhésion leucocytaire333. Dans l’athérosclérose et le diabète, des modifications du glycome liées à une diminution de l’activité des mannosidases sont observées. La N-glycosylation hautement mannosylée qui en résulte semble être impliquée dans le recrutement leucocytaire et pourrait participer à la chronicité de l’inflammation230,375,463. On sait justement que les RT augmentent la probabilité de développement des maladies vasculaires103,195, notamment par l’induction de lésion athérosclérotiques. L’irradiation de souris ApoE-/- induit une augmentation du nombre de plaques d’athéromes197,464. Chez la même lignée de souris, la diminution de l’activité des mannosidases provoque la modification des N-glycanes. Il est suggéré que cette modification pourrait constituer le mécanisme entre réaction auto-immun et athérogenèse361. Dans les lésions athérosclérotiques radio-induites, il serait intéressant d’évaluer le glycome afin de déterminer s’il influence le recrutement chronique.
Enfin, puisque l’inhibition de l’adhésion par le l’α-methylmannose ne supprime pas totalement l’adhésion radio-induite, cela signifie que les autres modifications de glycosylation identifiées, comme la sialylation, pourraient être impliquées. De plus, nous pourrions évaluer l’adhésion en flux turbulent, ce qui privilégierait les motifs reconnus par les sélectines et notamment le sLeX.
II.A.2. Importance de la sialylation et de la O-glycosylation
II.A.2.a. Sialylation augmentée
L’augmentation de la sialylation pourrait aussi influencer le recrutement leucocytaire en fournissant des ligands pour les sélectines, intégrines et récepteurs leucocytaires.
II.A.2.b. α2-3 sialylation et motifs Lewis X
Même si nous n’avons pas clairement identifié de motifs Lex ou sLeX sur les CE irradiées, la forte augmentation de l’α2-3 sialylation laisse penser que les motifs Lex, impliqués dans l’interaction avec les sélectines, pourraient être augmentés sur les CE après RI.
Le ligand PSGL-1 porte des motifs α2-3 sialylés sur un O-glycane (core 2) : il est classiquement retrouvé sur les leucocytes. En condition physiologique, seule une petite partie de PSGL1 exprime le motif sLeX et sert de ligand aux sélectines. Une augmentation de la part des motifs sLeX augmente
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l’adhésion230,367. Une forme endothéliale (ePSGL-1) a été identifiée sur les HUVECs activées. Ces dernières surexpriment l’ePSGL-1 et le TNF-α agit sur sa glycosylation. Ce ligand participe à l’adhésion des monocytes360. L’ePSGL-1 est donc un bon candidat pour expliquer l’augmentation des motifs α2-3 sialylés sur l’endothélium après irradiation. La L-sélectine pourrait notamment reconnaitre des motifs sLeX du ePSGL-1, comme elle le fait sur les PSGL-1 leucocytaires dans les interactions leucocytes-leucocytes sur les sites d’inflammation305. De plus, la présence de ce ligand sur l’endothélium et l’augmentation de la proportion de motifs α2-3 sialylés pourraient influencer positivement le recrutement des thrombocytes.
D’autres molécules porteuses de ligands des sélectines ont été identifiées sur les CE et particulièrement dans les HEV. Le CD34 peut être un ligand de la L-sélectine s’il porte le 6-sulfo-sialyl-Lewis X en abondance 312, ce qui serait le cas dans nos cellules irradiées . Madcam-1 porte également le sLeX et est reconnu par la L-sélectine. Cette glycoprotéine est particulièrement exprimée sur les CE en contexte inflammatoire chronique. Au niveau intestinal, elle semble jouer un rôle dans la rectocolite hémorragique465,466. MadCAM peut aussi interagir avec les intégrines VLA-4 et α4β7467–469. GlyCAM-1 est un ligand O-glycosylé (core 2) portant le motif 6-sulfo-sialyl-Lewis X et identifié comme un des ligands de la L-sélectine des plus influents dans le rolling des leucocytes470–473. Parmi les autres glycoligands potentiels de la L-sélectine, on trouve la podocalyxine, l’endomucine et la nepmucine245,474.
La chronicisation de l’inflammation pourrait conduire dans les lésions radio-induites à la formation d’organes lymphoïdes tertiaires. C’est par exemple le cas dans l’athérosclérose qui présente de ressemblances phénotypiques avec les vaisseaux irradiés475 . Les vaisseaux irradiés pourraient porter des glycoprotéines présentes dans les HEV476,477.
II.A.2.c. Sialylation en α2-6
L’α2-6 sialylation des glycoprotéines endothéliales a des fonctions contradictoires sur le recrutement des cellules circulantes. En contexte inflammatoire, l’augmentation de l’expression des cytokines (comme TNF-α et IL-1β) par l’endothélium vasculaire se traduit par l’augmentation de l’α2-6 sialylation212,478. Ces motifs α2-6 sialylés constituent des ligands pour le CD22 exprimé par les lymphocytes B et permet leur recrutement 200,335,478,479. A l’inverse, la forme majoritaire d’ICAM-1, porteuse de N-glycanes sialylés en α2-6, est diminuée en contexte inflammatoire au profit de la forme hautement mannosylée qui induit le recrutement des monocytes 333. De la même manière, l’α2-6 sialylation de VCAM-1 inhibe l’adhésion en flux 480.
La PECAM-1 endothéliale porte des motifs α2-6 sialylés340481 sur des N-glycanes biantennés482. La sialylation semble réduire la transduction de stimuli apoptotiques340 (cela reste controversé483) et est
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nécessaire à la formation des tubes durant l’angiogenèse 481. L’augmentation de la sialylation en α2-6 permet la création d’un complexe entre le VEGFR, la VE-cadhéine et les PECAM-1 sialylés de deux CE voisines (voir Figure 37). Ce complexe aux propriétés mécano-transductrices induit des signaux de survie et de prolifération. A l’inverse, une baisse de la sialylation rompt le complexe en empêchant les interactions homologues avec les PECAM-1 des CE voisines et potentialisant les interactions avec les galectines 1.484
Figure 37 :le niveau d’α2-6 sialylation régule l’angiogenèse (d’après Kitazume et al. 484).
Dans nos expériences, il est difficile de trancher. D’une part, les N-glycanes hautement mannosylés (donc non sialylés) sont augmentés, ce qui privilégie la dissociation du complexe. Cela pourrait expliquer la réduction radio-induite de la formation des tubes 485 et la diminution de la survie (même si les principaux facteurs de mortalité chez les CE restent les céramides et les dommage à l’ADN). A l’inverse, même si l’irradiation induit une baisse des formes complexes, la sialylation α2-6 est clairement augmentée et le complexe pourrait exister : cela soutient l’existence de signaux pro-angiogéniques aux temps tardifs où la sialylation est la plus forte.
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