Mode opératoire classique de l’ELISPOT

Dans les grandes lignes, le protocole utilisé est celui décrit par nos collègues pour la quantification de la réponse lymphocytaire B mémoire à un candidat vaccin dans le cadre du paludisme gestationnel (Gbédandé et al., 2017). L’utilisation et le choix des Ag parasitaires

mentionnés dans les opérations menées à J5, dans le tableau n°5, seront détaillées dans le chapitre III « Adaptation de la technique ELISPOT dans la toxoplasmose congénitale ».

J1 - Isolement des cellules mononucléées (CMN)

Le sang veineux est collecté dans un tube (9ml) contenant comme anticoagulant du Citrate Phosphate Dextrose Adénine, tube CPDA. Après dilution du sang total volume à volume avec du RPMI 1640 sans L-glutamine (Sigma) préchauffé à 37°C, les CMN du sang périphérique sont isolées par centrifugation en gradient de densité (Ficoll-Paque Premium, GE Healthcare), 30min à 2500 tours/min (t/min). Elles sont lavées deux fois 10min à 1500 t/min avec le RPMI 1640 préchauffé, puis dénombrées avec du bleu trypan (Eurobio) en cellules KOVA afin de connaître le nombre de cellules viables.

Si les cellules sont utilisées le jour même, elles sont gardées dans le RPMI 1640 dans une étuve à 37°C avec 5% de CO2. Sinon, elles sont remises en suspension dans une solution de

cryoconservation composée de sérum de veau fœtal décomplémenté (80% SVF Gold, GE Healthcare) et de diméthylsulfoxyde (20% DMSO, Sigma), et sont réparties de façon à avoir un minimum de 5.106 _{CMN par cryotube. Les cellules restent une nuit à -80°C avant d’être}

entreposées dans de l’azote liquide.

J1 - Décongélation des CMN

Les CMN sorties de l’azote liquide sont rapidement décongelées dans un bain-marie à 37°C, puis lentement re-suspendues volume à volume avec un milieu complet préchauffé à 37°C, appelé RPMIc. Deux lavages avec du RPMIc (5 à 10 ml) préchauffé sont effectués, 10min à 1400 t/min, pour enlever au maximum le DMSO, puis les cellules sont comptées comme précédemment, cellules vivantes versus cellules mortes. Après dénombrement, la solution cellulaire est ajustée avec du RPMIc pour avoir une solution de travail à 1.106 _cellules

viables/ml.

Le RPMIc contient 450ml de RPMI 1640 sans L-glutamine (Sigma), 5ml de sodium pyruvate 100mM (Gibco), 5ml de MEM non essential amino acids 100X (Gibco), 5ml de L-Glutamine 200mM (Gibco), 5ml de Pénicilline 10 000U/ml - Streptomycine 10 000µg/ml (Gibco), 500µl de 2-mercapto-éthanol 50mM (Gibco) et 50ml de SVF Gold décomplémenté (GE Healthcare).

J1 - Activation/différenciation des cellules B mémoires

Dans une plaque de culture 24 puits (Corning), on dépose comme témoin négatif 1ml de solution cellulaire de travail. Autrement, on dépose 1ml de solution cellulaire de travail en présence de 2,5µl de CpG ODN2006 à 1mg/ml (TibMolBiol) et 2µl d'IL-15 à 5µg/ml (R&D Systems), réactifs sur la composition desquels nous reviendrons plus loin. La plaque est incubée 5 jours à 37°C avec 5% de CO2.

J5 - Préparation de la plaque ELISPOT

Une plaque stérile PVDF 96 puits multiscreen HTS-IP (Millipore) est régénérée avec 15µl/puits d’éthanol à 70% (Fisher). Elle est ensuite lavée deux fois avec 200µl/puits de solution tampon saline 1X (DPBS pour Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline) sans calcium ni magnésium (Gibco). Puis suivant les cas, on dépose 100µl des différents réactifs présentés dans le tableau n°5. La plaque est hermétiquement fermée et incubée sur la nuit à +4°C. Cette étape peut être réalisée à J6, dans ce cas la plaque reste 2heures à température ambiante.

Réactifs Rôle Concentration [C] Provenance

DPBS 1X Témoin négatif - Gibco

Ac de chèvre anti-IgG humaine Témoin positif Détection de la réponse globale (ASC en IgG) [C] initiale 200µg/ml [C]/puits 5µg/ml Sigma Ag recombinant de T. gondii de type I (utilisé au début des

mises au point)

Détection de la réponse spécifique

(ASC en IgG anti-Ag recombinant)

[C] initiale 1000µg/ml

[C]/puits variable Jena Bioscience

Lysat parasitaire de T. gondii de type I

Détection de la réponse spécifique

(ASC en IgG anti- T. gondii de type I)

[C] initiale 2500µg/ml [C]/puits variable

CNR Toxoplasmose de Reims Tableau n°5. Réactifs déposés pour préparer la plaque ELISPOT.

J6 -Mise en contact des CMN avec la plaque ELISPOT

Deux opérations sont à mener en parallèle, la fin de la préparation de la plaque ELISPOT et le lavage des cellules. Après le retrait des réactifs adsorbés, la plaque est lavée deux fois avec 150µl/puits du mélange DPBS/BSA (DPBS 1X + 3% de Bovine Serum Albumin, Sigma), suit une étape de blocage avec 150µl/puits du mélange DPBS/BSA, incubés durant 30min à

température ambiante. Pendant ce temps, les cellules sont collectées et lavées deux fois avec du RPMIc préchauffé, 10min à 1400 t/min. Puis elles sont comptées comme décrit plus haut. Après numération, les différentes préparations cellulaires sont réajustées à 2.106 _cellules

viables/ml dans du RPMIc.

A la fin de l’étape de blocage, la plaque est lavée deux fois avec 200µl/puits de DPBS 1X. Puis, en dupliquat, 100µl de suspension cellulaire sont déposés dans les puits témoins négatifs ou ceux revêtus de l’Ag d’intérêt, et des dilutions en série (1/2) sont effectuées dans du RPMIc (volume final : 100µl) au niveau des puits témoins positifs. La plaque est ensuite incubée une nuit dans une étuve à 37°C avec 5% de CO2.

J7 -Lavages de la plaque ELISPOT et révélation

Les solutions cellulaires sont enlevées et la plaque lavée cinq fois activement puis deux fois normalement avec 150µl/puits de tampon de lavage (DPBS 1X + BSA 3% + 0,5% Tween 20). L’Ac secondaire, Ac de chèvre anti-IgG humaine biotinylé (Sigma) dilué au 1/500ème _{dans du}

DPBS 1X/BSA 3% et filtré, est ajouté à raison de 100µl/puits. La plaque est incubée 2 heures à température ambiante à l’obscurité, puis lavée sept fois comme précédemment.

Ensuite 100µl/puits d’ExtrAvidine-péroxydase (Sigma) diluée au 1/600ème _{sont ajoutés et la}

plaque reste une heure à température ambiante à l’obscurité. Elle est ensuite lavée trois fois avec 200µl/puits de DPBS 1X, puis 100µl/puits d’une solution chromogène (3-amino-9- éthylcarbazole, AEC ; Sigma) sont déposés. On laisse la révélation se faire durant 10 min à température ambiante à l’obscurité, puis on jette le contenu, on enlève avec précaution l’opercule en plastique qui se trouve sous la plaque et on rince abondamment la plaque avec de l’eau osmosée.

La plaque est ensuite placée à température ambiante à l’obscurité le temps de son séchage, avant d’être lue à l’aide d’un automate de lecture de plaque ELISPOT AID (AutoImmun Diagnostika, GMBH) qui permet de dénombrer les spots formés grâce à son logiciel de traitement des données. La lecture peut parfois se réaliser à J8, si la plaque n’est pas complètement sèche.