1-Choix de l’antigène parasitaire

En premier lieu, la protéine majeure de surface de T. gondii, SAG1 (Surface Antigen 1) a été utilisée pour le revêtement des membranes, dans la mesure où cet Ag est généralement utilisé sous sa forme de protéine recombinante rec-SAG1 dans les techniques sérologiques ELISA. Des mises au point ont été faites pour déterminer la concentration minimale nécessaire pour mettre en évidence la population de LyB spécifiquement productrice d’Ac anti-SAG1. Nous avons testé en quadrupliquat les CMN de 4 individus déjà immunisés contre la toxoplasmose avec trois concentrations différentes de SAG1 (5µg/ml, 10µg/ml et 20µg/ml). Les résultats obtenus permettent de valider cette approche et ont été présentés à l’occasion de la journée des jeunes chercheurs organisée par le Département Hospitalo Universitaire (DHU) Risques et Grossesse de l’Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) sous forme d’une présentation affichée qui se trouve en annexe n°2.

Cependant, l’utilisation d’un seul Ag paraissait trop restrictive, car si certains Ag sont exprimés à tous les stades du cycle parasitaire, d’autres sont d’expression plus fugace (Denis, Médecine Science Sélection, 2002). La pertinence de l’utilisation d’un mélange de protéines recombinantes ou bien d’un lysat parasitaire s’est posée.

L’utilisation d’un mélange de protéines recombinantes suppose la connaissance des différents Ag produits au cours du cycle parasitaire ainsi que de ceux qui permettent de détecter les IgM et/ou les IgG produites en fonction du type d’infection, aiguë ou chronique.

Les premiers articles analysant les protéines de surface de T. gondii montraient la présence de plusieurs protéines en quantité plus ou moins importante, caractérisées par leurs poids

moléculaires et affiliées par défaut à celles exprimées à la surface du parasite (Handman et al., 1980 ; Couvreur et al., 1988 ; Boothroyd et al., 1998). Or, parmi les cinq protéines les plus immunogènes identifiées, étaient incluses la protéine majeure de surface P30 (Protéine de 30 kDa), ensuite appelée SAG1 (Sibley et al., 1991), P22-SAG2 et P43-SAG3, mais aussi deux protéines excrétées de granules denses (GRA), P23/24-GRA1 et P35-GRA8. Depuis, dans le cadre de l’optimisation de la technique ELISA principalement pour réaliser un diagnostic précoce de la toxoplasmose congénitale, d’autres Ag parasitaires ont été identifiés (figure n°30) et leurs protéines recombinantes synthétisées afin d’utiliser les épitopes les plus immunogènes (Aubert et al., 2000).

Figure n°30. Organelles sécrétoires contenant des protéines caractéristiques chez T. gondii. D’après illustration de Dziadek et Brzostek, 2012 et complétée de Kotesha et Noordin, 2010.

Qu’ils les testent de façon indépendante ou sous forme de cocktails antigéniques, les auteurs choisissent les Ag en fonction de ce qu’ils cherchent à révéler : chronologie d’apparition des mêmes isotypes dirigés contre différents Ag reflétant le stade parasitaire, infection récente ou ancienne, intensité de réponse IgG et IgM ou identification des Ag appelant une réponse Ac très précoce. Il ressort de ces travaux que la plus-value apportée par l’utilisation d’un mélange d’Ag ne doit pas dépasser 3 à 4 protéines recombinantes, que ce mélange doit être spécifique du stade parasitaire (début de cycle, fin de cycle) et qu’il est préférable d’y inclure un Ag hautement immunogène (Aubert et al., 2000 ; Li et al., 2000 b) ; que les Ac anti-SAG1 n’apparaissent pas en début d’infection (Pfrepper et al., 2005) et que l’inclusion des Ag GRA semble nécessaire puisqu’ils constituent une fraction importante des Ag circulant dans le sang durant les premières heures suivant l’infection et ont été identifiés comme marqueurs d’une infection aiguë (Golkar et al., 2008), notamment GRA6 (Golkar et al., 2008) et GRA8 (Li et al., 2000 a et 2000 b ; Suzuki et al., 2000 ; Pfrepper et al., 2005), ce dernier ayant été étudié dans la réponse Ac au sein d’une population de femmes enceintes. Les Ac anti-GRA4 et anti-GRA7 ont été détectés chez des enfants de moins de 4 mois suspectés de TC (Altcheh et al., 2006 ; Pfrepper et al., 2005). Les Ag recombinants MIC permettent également de faire la distinction

entre les enfants de moins de 3 mois infectés ou non issus de mères ayant eu une primo- infection toxoplasmique durant la grossesse (Buffolano et al., 2005).

Ainsi pour notre étude, l’utilisation d’un mélange antigénique, le plus immunodominant possible et spécifique de stade (Aubert et al., 2000 ; Kotresha et Noordin, 2010), est nécessaire pour permettre la détection de la plus large population lymphocytaire réactive possible. L’utilisation des Ag recombinants a l’avantage de standardiser les techniques au profit des utilisateurs. Cependant elle a l’inconvénient de limiter le spectre de la réponse étudiée et la comparaison des résultats pour un même épitope antigénique est délicate puisqu’elle dépend de la réponse Ac en lien avec la zone recombinée de l’épitope qui diffère d’un fournisseur à l’autre (Kotresha et Noordin, 2010).

Notre objectif étant de capturer la réponse Ac spécifique la plus diverse possible, même en cas de faible signal, l’utilisation d’un lysat parasitaire semble la plus adaptée. Un autre avantage du lysat parasitaire réside dans son éventuelle capacité à mieux révéler, que ne le feraient les Ag recombinants, la réponse Ac particulière qu’est celle issue des LyB néonatals. Ainsi, le lysat parasitaire de T. gondii de type I est une bonne option car il permet de mettre en évidence davantage d’Ac spécifiques de la toxoplasmose qu’un Ag recombinant seul ou associé à d’autres, tout en étant représentatif de la cinétique des stades parasitaires, ce qui augmente nos chances de détecter les Ac toxoplasmiques spécifiques du nouveau-né s’ils sont peu nombreux.

La suite des mises au point s’est faite avec ce lysat qui a l’avantage de présenter toute la mosaïque antigénique de T. gondii. Et dans ce cas de figure, l’inclusion d’un témoin négatif, réalisé sur des cellules stimulées et non stimulées d’un individu n’ayant jamais été en contact avec le parasite, est d’autant plus justifiée pour exclure d’éventuelles réponses non spécifiques trouvées lors d’études antérieures sur la toxoplasmose (Potasman et al., 1986 a et 1986 b). Différentes concentrations de lysat parasitaire, dont la gamme allait de 20µg/ml à 100µg/ml, ont été testées sur des CMN d’un individu séropositif et d’un individu séronégatif à la toxoplasmose. Le résultat des comparaisons entre SAG1 et le lysat de T. gondii de type I, pour lequel la concentration de 20µg/ml a finalement été retenue, est présenté sur la figure n°31 et a été exploité pour argumenter plusieurs demandes de financements.

Figure n°31. Détermination d’ASC sécrétrices d’IgG dirigées contre SAG1 (expérience A) vs. lysat de T. gondii de type I (expérience B).

E1 : CMN issues d’un adulte séropositif à la toxoplasmose. E2 : CMN issues d’un adulte séronégatif à la toxoplasmose. Cet essai montre la faisabilité de la technique dans un contexte de toxoplasmose ancienne. Expérience A : visualisation de la population d’ASC spécifiques sécrétrices d’IgG anti-SAG1 de T. gondii. Expérience B : visualisation de la population d’ASC spécifiques sécrétrices d’IgG anti-lysat parasitaire de T. gondii. Le test est validé par l’absence d’ASC d’IgG en l’absence de stimulation (Cns) et par la présence d’un grand nombre d’ASC d’IgG totales (à droite).