2-2-2-Les techniques de diagnostic indirect

En général, ce sont les IgM et IgG spécifiques du toxoplasme qui sont principalement recherchées et leur apparition au cours de l’infection se fait par l’étude de leur cinétique, comme l’illustre la figure n°11.

Cependant, une vigilance doit être apportée quant à l’interprétation des résultats, puisque la présence d’IgM n’est pas exclusive d’une infection récente. De plus, une précaution est à prendre concernant le choix des tests sérologiques utilisés. Effectivement, la cinétique antigénique doit être prise en considération pour la mise en évidence de l’isotype d’Ig. Les tests utilisant des Ag d’un lysat parasitaire, Ag entier, ou un Ag parasitaire de membrane, détectent les Ac produits précocement, tandis que ceux utilisant un mélange d’Ag cytosoliques ou métaboliques en plus de ceux de surface, détectent les Ac produits plus tardivement. De plus, le traitement anti-parasitaire joue un rôle sur le système immunitaire

et peut ralentir la cinétique d’évolution des Ac, donc impacter les résultats sérologiques (HAS, 2017).

Figure n°11. Schéma théorique de la cinétique évolutive des Ig durant une toxoplasmose. Source : Bessières et al., 2006.

Sabin-Feldman dye-test : Gold standard

Cette technique permet la détection conjointe des IgG et des IgM. En utilisant un microscope à contraste de phase, la lyse des parasites est observée suite à l’incubation de dilutions sériques avec le parasite vivant en présence de complément. Son remplacement par une autre technique, comme l’immunochromatographie, plus rapide, est en cours d’évaluation par le CNR Toxoplasmose.

Limites : il est nécessaire d’inactiver le sérum et d’entretenir une culture de parasites vivants très virulents ; le complément doit provenir de sérum frais sans Ac anti-Toxoplasma.

Immunofluorescence indirecte (IFI)

A l’aide d’un microscope à fluorescence, cette technique permet la détection des IgM et des IgG spécifiques. Les tachyzoïtes entiers sont fixés au formol sur une lame et sont mis en contact avec des dilutions sériques.

Limites : lecture délicate ; risque de faux positifs en présence de facteurs antinucléaires ou de facteurs rhumatoïdes ; risque de faux négatifs si le taux d’Ig est faible ; technique longue.

Agglutination directe

Des dilutions sériques sont mises en contact avec une suspension de parasite entier afin de détecter conjointement les IgM et les IgG. Des hématies de mouton ou des billes de latex sont utilisées. Pour une détection des IgG uniquement, le test dit d’Agglutination Directe Haute Sensibilité nécessite l’ajout de trypsine et de 2-mercaptoéthanol.

Limite : maintien en culture de parasites, manque de sensibilité lorsque le titre d’Ig est faible.

Agglutination différentielle

Cette technique permet de comparer, à 6-12 mois d’intervalle, des titres d’IgG obtenus par agglutination sur des parasites entiers fixés avec des solutions différentes, formol ou méthanol. Le traitement au formol garde intact les Ag produits tout au long de l’infection. Le traitement au méthanol permet de mettre en évidence les Ac précocement produits. Limites : les différents Ag ne sont pas commercialisés, donc un maintien en culture de parasites est nécessaire ; la préparation des solutions est délicate.

Technique d’Immuno-Sorbent Agglutination Assay (ISAgA)

C’est une technique d’immuno-capture des IgM sériques diluées sur une phase solide sensibilisée par un Ac recombinant anti-IgM humaines. Après lavage, le toxoplasme formolé est ajouté. Un voile se forme au fond de la cupule si une reconnaissance Ag-parasitaire/IgM spécifique se fait. La détection des IgA et des IgE peut également se faire selon le même principe. Cette technique est utilisée pour détecter une infection récente.

Limite : bien que le test soit commercialisé, il demande une expertise technique.

Agglutination indirecte

Elle utilise des Ag extraits de tachyzoïtes fixés à des billes de latex.

Limites : le résultat du test dépend de la qualité des Ag parasitaires préparés ; résultats faussement négatifs si le taux d’Ac est élevé (phénomène de zone) ; il n’y a pas de distinction possible des isotypes des Ig dans ce mode de détection.

Test ELISA

C’est la technique automatisable la plus utilisée dans le diagnostic. Généralement, les Ag parasitaires sont adsorbés sur un support solide. Les sérums dilués sont ajoutés et les complexes immuns se forment. Après lavages, un Ac secondaire anti-isotype, i.e. anti-IgG, couplé à une enzyme est ajouté et se fixe sur le complexe immun. La révélation se fait par l’ajout d’un substrat avec son chromogène. La mesure de la densité optique est faite après ajout d’une solution stoppant la réaction enzymatique.

Cette technique est également utilisée pour mesurer l’avidité des IgG. Une étape de lavage avec de l’urée, agent dissociant des liaisons Ag-Ac, est ajoutée après la formation des complexes immuns. L’avidité est faible en début d’infection et augmente au fil du temps. Cette variation technique est utilisée moins pour dater l’infection que pour exclure une infection récente, lorsque les tests sérologiques montrent la présence d’IgM qui peuvent persister longtemps après une primo-infection.

Limites : des réactions croisées donnant de faux positifs sont signalées dans les cas de maladies auto-immunes ou dans un contexte infectieux autre durant l’analyse ; une disparité des résultats suivant les Ag parasitaires utilisés est observée lors de la comparaison de plusieurs automates (Villard et al., 2016 b) ; pour l’ELISA urée, bien que commercialisée, son interprétation peut être délicate (Smets et al., 2016).

Immunoblot ou Western blot

Cette technique est utilisée pour i/lever le doute sur la présence des IgG lorsque les résultats des tests sérologiques de première intention sont douteux et/ou discordants et ii/ la comparaison de profils immunologiques entre deux compartiments biologiques ou entre deux individus (mère/enfant), comme illustré sur la figure n°12. Elle remplace la technique Enzyme- Linked Immunofiltration Assay (ELIFA). Les Ag parasitaires cibles sont déposés sur une membrane, et se positionnent selon leur poids moléculaire. Les sérums sont ensuite déposés sur la membrane. La révélation permet de visualiser différentes bandes d’intérêt.

Figure n°12. Comparaison du profil sérologique du couple mère/enfant.

Couple A : la mère (m) a été contaminée durant la grossesse et son enfant (e) est indemne, ils ont le même profil sérologique IgG (IgG transmises). Couple B : la mère a été contaminée durant la grossesse et son enfant aussi, comme en témoigne la présence de bandes supplémentaires (flèches noires).

Source : http://www.ldbiodiagnostics.com.