Mode d’obtention des hydrogels PUL-FA

Comme mentionné précédemment, les hydrogels à base de PUL-FA sont obtenus par voie enzymatique, voie douce et respectueuse de l’environnement. En effet, les motifs d’acide férulique greffés sur le pullulane sont capables de se dimériser via une réaction radicalaire en présence d’une enzyme oxydase comme la laccase. En présence de la laccase, les greffons de FA vont être oxydés et transformés en des radicaux très réactifs appelés quinones qui peuvent se condenser formant ainsi des dimères d’acide férulique. Différentes formes de radicaux peuvent être créés suite à l’action de l’enzyme et par conséquent cinq formes de dimères sont possibles dont deux sont les plus abondantes (voir Chapitre A-III.2.1.2). Par conséquent, la gélification devrait se produire par la création de points de réticulation covalents (dimère) entre deux greffons d’acide férulique appartenant à deux chaînes polymères différentes (Figure C-19). Si la réticulation menant à l’hydrogel sera la conséquence de dimères intermoléculaires, l’établissement de dimères intramoléculaires reste toujours envisageable (voir conclusion de la partie II-2-2).

Le bon déroulement de la réaction de réticulation nécessite donc une concentration en produits greffés PUL-FA supérieure à C* pour favoriser la réticulation intermoléculaire, un tampon citrate/phosphate 0,1 mol/L (pH= 5,5) et une température de 25°C pour une réactivité optimale de la laccase de Trametes versicolor. Ces paramètres ont été pris en compte pour la conception des hydrogels.

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III.2. Étude rhéologique

La réaction de réticulation des dérivés greffés PUL-FA par la laccase en régimes semi-dilué et concentré a été suivie par rhéologie en mode dynamique à une température de 25°C en utilisant la géométrie doubles-cylindres concentriques en raison des faibles viscosités initiales (≤ 3 Pa.s) des solutions PUL-FA mesurées précédemment. La mesure des valeurs de G’ et de G’’ en fonction du temps nous a permis de suivre la cinétique de formation des hydrogels de PUL-FA et d’évaluer leurs propriétés viscoélastiques à élastiques. Toutes les mesures ont été effectuées à une faible déformation (2%) et à une fréquence de 1 Hz pour assurer la linéarité des propriétés viscoélastiques lors de la réaction (passage d’un état liquide à un gel). Le tampon citrate/phosphate a été utilisé pour dissoudre la laccase à une concentration de 1 g/L et les produits obtenus PUL-FA à trois concentrations différentes 40, 70 et 100 g/L. Une petite quantité de la solution d’enzyme (ne modifiant pas sensiblement la concentration en polymère) a été ajoutée pour se placer à une valeur désirée d’activité enzymatique.

La Figure C-20 représente un exemple des courbes suite au suivi cinétique d’une réaction de formation d’un hydrogel à partir de la solution du dérivé greffé PUL-FA-6% à 70 g/L à 25°C avec une activité de 1 nkat en laccase.

Figure C-20 : Variations de G’ (module de conservation : bleu), de G’’ (module de perte : vert) et de

tan δ (= G’’/G’ : gris) à 1Hz en fonction du temps d’une solution de PUL-FA-6% à 70 g/L dans le tampon citrate/phosphate (0,1 mol/L, pH=5,5) lors de la réaction de réticulation à 25°C par la laccase

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Toutes les courbes obtenues lors des analyses rhéologiques ont montré un profil similaire à celui de la Figure C-20.

Des études antérieures ont rapporté des courbes similaires lors de gélification de polysaccharides en utilisant le même processus de réticulation^34,35. Ce profil de gélification est également similaire à celui d’autres hydrogels formés par réticulation physique ou chimique1,36.

Au début, on part d’une solution majoritairement visqueuse (G’’>> G’) avec des valeurs très faibles de G’ et G’’. Ensuite, on observe rapidement une forte augmentation de G’ qui devient supérieur au G’’. À la fin, les deux modules tendent à atteindre un plateau ou un pseudo-plateau avec des valeurs de G’ qui ont augmenté de trois décades par rapport à la solution initiale, signe de la création d’un hydrogel élastique (G’ >> G’’). L’allure de ces courbes est caractéristique d’une gélification induite par la réticulation par dimérisation des motifs greffés d’acide férulique par la laccase. Un point caractéristique de ces courbes est le temps où les deux modules G’ et G’’ sont égaux. Ce point d’intersection (tan δ = 1) a fait l’objet d’un important débat scientifique dans la littérature. Certains chercheurs le considèrent comme étant le point de gélification tandis que d’autres le définissent comme étant un point caractéristique de gélification indiquant le début de formation du gel par une transition de la phase purement liquide à la phase solide (gel) dominée par un comportement viscoélastique³⁷.

Nous considérons que ce point est difficilement corrélable à une notion de percolation par exemple mais il demeure un point tout à fait caractéristique de la gélification observée. Dans la suite de ce mémoire, nous utiliserons donc le temps correspondant au point de croisement G’ = G’’ que nous appellerons tgel pour temps de transition sol/gel.

Pour obtenir une série d’hydrogels aux propriétés mécaniques différentes, plusieurs réactions de réticulation ont été réalisées sur les différents PUL-FA (2 ; 6 et 10%) en variant l’activité enzymatique (0,5, 1 et 2 nkat) et la concentration en PUL-FA (40, 70 et 100 g/L). Les valeurs des temps de point d’intersection G’ = G’’ (tgel), des modules notamment élastiques (G’) pris au plateau ou du moins en fin de réticulation et renseignant sur les propriétés mécaniques finales des hydrogels obtenus, ainsi que tan δ sont regroupées dans le Tableau C-6.

177 Tableau C-6 : Données rhéologiques des réactions de réticulation des solutions PUL-FA dans le tampon citrate/phosphate (0,1 mol/L, pH=5,5) à 25°C

Produit [C] (g/L) AE (nkat) tgel (min) G’a (Pa) G”a (Pa) tan δa PUL-FA-2% 70 0.5 55 170 2 0.01 PUL-FA-6% 40 1 13 260 4 0.02 PUL-FA-6% 70 0.5 33 340 9 0.03 PUL-FA-6% 70 1 17 380 13 0.03 PUL-FA-6% 70 2 8 410 17 0.04 PUL-FA-6% 100 1 20 570 25 0.03 PUL-FA-10% 70 0.5 24 440 19 0.03

a Valeurs prises au ‘plateau’ en fin de réticulation

Les valeurs de tan δ obtenues varient entre 0,01 à 0,04 (< 1) et sont bien caractéristiques d’un hydrogel élastique covalent38. L’hydrogel possédant les propriétés mécaniques les plus faibles présente un module d’élasticité de 170 Pa au plateau alors que celui aux propriétés les plus élevées atteint une valeur de 570 Pa. Tous les hydrogels obtenus ont démontré des propriétés mécaniques plus importantes que ceux obtenus par Carvajal et al. à partir des WEAX, arabinoxylanes naturellement porteur de FA et extraits à l’eau de graines de blé (G’ compris entre 5 et 41 Pa)²⁷. Ce résultat montre donc que l’on est capable de ‘mimer’ avec succès les systèmes observés dans la nature mais nous avons également réussi à améliorer les propriétés mécaniques des hydrogels grâce à des taux de FA sur la chaîne polysaccharide plus importants.

Pour mieux comprendre le comportement de ces hydrogels et la cinétique de la réaction de gélification (Tableau C-6), les influences de l’activité enzymatique, du degré de substitution en acide férulique (DSFA) et de la concentration en PUL-FA ont été examinées séparément dans la suite de l’étude.

III.2.1. Influence de la quantité d’enzyme

L’étude de l’effet de l’activité enzymatique sur la cinétique de la gélification et les propriétés physico-chimiques a été réalisée sur les hydrogels formés à partir des solutions de PUL-FA-6% en fixant la concentration à 70 g/L et en faisant varier la quantité d’enzyme

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introduite (0,5, 1 et 2 nkat). La Figure C-21 présente les courbes obtenues de G’ et G’’ en fonction du temps.

Figure C-21 : Influence de l’activité enzymatique sur la réaction de gélification et les propriétés des

hydrogels : courbes G’ (symbole plein) et G’’ (symbole vide) à 1Hz en fonction du temps de la réaction de gélification à 25°C de solution PUL-FA-6% à 70 g/L dans le tampon citrate/phosphate (0,1

mol/L, pH=5,5) en utilisant une activité de laccase de 0,5 nkat (vert), 1 nkat (bleu) et 2 nkat (rouge)

Sur la Figure C-21, on constate que les courbes de G’ et G’’ des différents échantillons analysés ont tendance à atteindre des plateaux de même niveau de G’ à la fin de la mesure rhéologique et par conséquent on obtient des hydrogels aux propriétés mécaniques quasi identiques. Cependant, on remarque que ces plateaux ne sont pas atteints au même moment et si on regarde le point de croisement des deux modules G’ et G’’, on observe que tgel diminue quand la quantité d’enzyme (AE) augmente. Le plateau est atteint plus rapidement par une activité enzymatique plus élevée. Les valeurs numériques du Tableau C-6 confirment cette impression : G’ quasi constant des hydrogels de PUL-FA-2% de 340, 380 et 410 Pa pour les trois activités enzymatiques testées avec des temps de gel décroissants (33, 17 et 8 min) avec l’augmentation de l’activité enzymatique variant de 0,5 à 2 nkat.

De ce fait, la laccase n’a qu’un effet sur la cinétique de la gélification et n’a aucun effet sur les propriétés mécaniques finales des hydrogels (même nombre de liens formés) ce qui est en accord avec le rôle catalytique de cette enzyme dans la réaction de réticulation.

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III.2.2. Influence du degré de substitution

Pour comparer l’effet du degré de substitution en acide férulique sur la cinétique de la réaction de réticulation et sur les propriétés mécaniques des hydrogels, nous avons choisi de travailler à concentration en polymère et à activité enzymatique fixes de 70 g/L et 1 nkat, respectivement. Les mesures rhéologiques ont été effectuées sur les produits greffés PUL-FA-2%, PUL-FA-6% et PUL-FA-10% (Figure C-22).

Figure C-22 : Influence du degré de substitution sur la réaction de gélification et les propriétés des

hydrogels : courbes G’ (symbole plein) et G’’ (symbole vide) à 1 Hz en fonction du temps de la réaction de gélification à 25°C par la laccase (1nkat) de solutions de PUL-FA-2% (vert), PUL-FA-6%

(bleu) et de PUL-FA-10% (rouge) à 70 g/L dans le tampon citrate/phosphate (0,1 mol/L, pH=5,5)

La Figure C-22 montre cette fois des différences tant au niveau des propriétés mécaniques finales que de la cinétique. En effet, lorsque le DSFA varie de 2 à 10%, G’ et G’’ au plateau augmentent respectivement de 170 à 440 Pa et de 2 à 19 Pa tandis que temps de gel diminue de 55 à 24 min (Tableau C-6). Ainsi, le degré de substitution en acide férulique affecte non seulement les caractéristiques des hydrogels obtenus mais aussi la cinétique de la réaction de réticulation. Le réseau 3D se forme plus rapidement avec des propriétés mécaniques plus importantes lorsque le DSFA est plus important.

Cela s’explique assez logiquement, en effet plus le DS en FA augmente, plus le nombre de liens potentiels de réticulation augmente (i.e. valeur du module au plateau). La présence d’un grand nombre de greffons dans le milieu quand le DS en FA augmente permet aussi d’établir les liens plus rapidement et explique ainsi également l’amélioration de la cinétique.

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III.2.3. Influence de la concentration

Nous avons finalement investigué l’influence de la concentration en PUL-FA sur la vitesse de formation des hydrogels et sur leurs propriétés mécaniques finales. Pour cela, les analyses rhéologiques ont été menées sur le dérivé PUL-FA-6% en utilisant une quantité d’enzyme de 1 nkat et en faisant varier la concentration (40, 70 et 100 g/L) (Figure C-23).

Figure C-23 : Influence de la concentration sur la réaction de gélification et les propriétés des

hydrogels : courbes G’ (symbole plein) et G’’ (symbole vide) à 1Hz en fonction du temps de la réaction de gélification à 25°C par la laccase (1 nkat) des solutions PUL-FA-6% dans le tampon

citrate/phosphate (0,1 mol/L, pH=5,5) à 40 g/L (vert), 70 g/L (bleu) et 100 g/L (rouge)

Assez logiquement, les modules élastiques au plateau augmentent avec la concentration (voir Tableau C-6). En effet, l’augmentation de la concentration se traduit par un enchevêtrement des chaînes polymères plus dense mais aussi à une probabilité de rencontre des FA greffés améliorée (i.e. liens de réticulation potentiels). Ce phénomène est en plus probablement accentué par la présence d’associations hydrophobes intermoléculaires mises en évidence dans la partie précédente permettant d’envisager une réactivité (réticulation) entre greffons acide férulique plus importante.

Sur l’aspect cinétique, les résultats peuvent apparaître plus surprenants puisque la cinétique diminue légèrement (entre 17 et 37 min) avec l’augmentation de la concentration en polymère. Une explication peut conduire à considérer un enchevêtrement plus important à forte concentration en polymère pouvant affecter la mobilité de l’enzyme et ralentissant la vitesse de réticulation.

Par conséquent, la concentration joue un rôle sur la cinétique de la réaction de réticulation ainsi que sur les propriétés physico-chimiques finales des hydrogels.

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III.3. Propriétés de gonflement

Dans le but de vérifier leur affinité avec l’eau, le gonflement des hydrogels de PUL-FA a été étudié dans l’eau pure (milli-Q). Généralement, la capacité de gonflement d’un hydrogel à l’équilibre dépend fortement de la structure moléculaire du réseau polymère, de la densité de réticulation et des interactions des composants de l’hydrogel. C’est pour cette raison que l’effet de la quantité d’enzyme, du degré de substitution en acide férulique et de la concentration sur la cinétique et sur les propriétés de gonflement a été étudié et représenté respectivement dans les Figures C-24-A, C-24-B et C-24-C.

Figure C-24 : Influence sur les propriétés de gonflement dans l’eau milli-Q de : A) l’activité

enzymatique pour l’hydrogel obtenu à partir de PUL-FA-6% (40 g/L). B) le degré de substitution en acide férulique pour les hydrogels obtenus à partir de PUL-FA-2%, PUL-FA-6% et PUL-FA-10% à 40

g/L avec une activité enzymatique de 1 nkat. C) la concentration en polysaccharide pour les hydrogels obtenus à partir de PUL-FA-6% avec une activité enzymatique de 1 nkat

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Les courbes obtenues montrent une cinétique de gonflement en deux temps. Pour débuter, sur les premières heures, l’absorption d’eau est rapide. Ensuite, l’équilibre est très long à atteindre avec une très lente et faible augmentation du gonflement sur une semaine. Le taux de gonflement maximal (13,3 g×g^-1) a été mesuré avec l’hydrogel obtenu à partir du dérivé le moins greffé (PUL-FA-2%) à la concentration la moins élevée (40 g/L). Ce gonflement est relativement faible en raison du caractère neutre de la chaîne polymère.

Les courbes de gonflement des hydrogels formés à partir du PUL-FA-6% à 40 g/L en utilisant trois activités enzymatiques différentes 0,5, 1 et 2 nkat (Figure C-24-A) montrent un profil identique avec le même degré de gonflement à chaque point de mesure. Ainsi, en accord avec les résultats de l’étude rhéologique, la quantité d’enzyme n’a pas d’effet sur les propriétés de gonflement des hydrogels puisque la densité de réticulation est constante.

La Figure C-24-B représente le gonflement des hydrogels élaborés avec les échantillons PUL-FA-2%, PUL-FA-6% et PUL-FA-10% à 40 g/L et une quantité de laccase de 1 nkat. Cette figure prouve que la quantité d’acide férulique greffée a un impact sur les propriétés de gonflement des hydrogels PUL-FA. La réduction du DSFA entraîne une augmentation de gonflement en raison d’une diminution de la densité de réticulation ce qui facilite la pénétration de l’eau entre le réseau de l’hydrogel. Ce résultat est également conforme avec les mesures rhéologiques précédentes. Une constatation identique a été obtenue en étudiant l’effet de la concentration sur la cinétique de gonflement de l’hydrogel de PUL-FA-6% à 40, 70 et 100 g/L en fixant une activité enzymatique à 1 nkat (Figure C-24-C).

Par conséquent, on peut conclure que les analyses des propriétés de gonflement ont montré des quantités d’absorption relativement faibles et lentes en raison du caractère non ionique des hydrogels. Tous les résultats sont en accord avec l’étude rhéologique précédente avec des tendances antagonistes entre gonflement et propriétés mécaniques.