R- NH2 avec R= butyle,
III. Étude de la gélification
III.1. Mesure de l’activité enzymatique de la laccase
Cette partie concerne uniquement les hydrogels biomimétiques obtenus par voie enzymatique à partir des dérivés greffés acide férulique.
La laccase (p-diphénol : dioxygène oxydoréductase) appartient à la famille des enzymes oxydases multi-cuivres. Chaque molécule contient quatre ions cuivre capables d’oxyder des noyaux aromatiques tel que les composées phénoliques en utilisant l’oxygène comme accepteur d’électrons permettant l’élimination des radicaux hydrogène des fonctions hydroxyle8. La laccase possède 15 à 30% de glucides et une masse molaire comprise entre 6×104 et 9×104 g/mol9. Elle est largement distribuée dans les bactéries, les champignons et les insectes.
Au cours de nos travaux, nous avons utilisé deux laccases d’origine différente. La première provient du champignon Trametes veriscolor tandis que la seconde est extraite du champignon Pleurotus ostreatus. Ces deux enzymes (EC 1.10.3.2) ont été achetées chez Sigma avec des activités respectives ≥ 0,5 U/mg et ≥ 4 U/mg. Une unité d’enzyme (U) correspond à la quantité de la laccase nécessaire pour oxyder 1μmol de pyrocatéchol (benzène-1,2-diol) par minute à 25 °C, à pH 5 dans le cas de la laccase de Trametes veriscolor et à pH 4,5 dans le cas de la laccase de Pleurotus ostreatus (données fournies par Sigma).
Avant de procéder à la gélification des dérivés de polysaccharides greffés acide férulique (PUL-FA, CMP-FA et HA-FA), nous avons souhaité évaluer l’activité des deux laccases utilisées afin de ne pas raisonner en masse d’enzyme mais en activité d’enzyme afin de s’affranchir de ce paramètre qui peut varier d’un lot à l’autre ainsi que dans le temps. Cette activité est obtenue via l’oxydation de la syringaldazine (SGZ)10,11.Pour cela, la laccase est solubilisée dans un tampon citrate/phosphate (0,1 mol/L, pH= 5,5) à une concentration de 0,1 g/L. En même temps, la syringaldazine est solubilisée dans l’éthanol à une concentration de 0,8 mM. Puis, dans une cuve semi-micro (VWR, France), on introduit 20 μL de la solution de laccase, 350 μL de la solution de SGZ et 1,63 mL du tampon citrate/phosphate. Un suivi cinétique de l’oxydation enzymatique de la SGZ est réalisé pendant 3 min en mesurant l’absorbance de la solution à une longueur d’onde de 530 nm chaque 5 secondes à l’aide du spectrophotomètre UV-visible Cary 100 Bio (Varian, USA). La mesure de l’absorbance permet
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de remonter à la concentration de SGZ oxydée en utilisant le coefficient d’extinction (ε) de 65000 L/mol.cm12. L’activité enzymatique de la laccase est déterminée à partir de la pente de la partie linéaire au début de la courbe de la concentration de SGZ oxydée en fonction du temps (Figure B-13).
Figure B-13 : Évolution de la concentration de SGZ oxydée ([SGZ]initiale = 0,14 mM) lors de l’action de la laccase de Trametes versicolor ([laccase]initiale = 10-3 g/L) en fonction du temps
dans le mélange tampon citrate-phosphate/éthanol (82,5/17,5, v/v) à 25°C (partie linéaire de la courbe en rouge)
Le rapport pente / concentration en laccase correspond à l’activité de l’enzyme. Cette analyse a été réalisée trois fois avec une très bonne répétabilité qui donne dans notre cas une activité de 3,5 μmol min−1 mg−1 c’est-à-dire 3,5 U mg−1 ou 58,3 nkat mg−1 (avec 1𝑈 =
1
6× 102 𝑛𝑘𝑎𝑡) pour la laccase de Trametes versicolor et une activité de 6 U mg−1, soit 100 nkat mg−1 pour la laccase de Pleurotus ostreatus. Une unité d’enzyme (U) est définie comme étant la quantité de la laccase nécessaire pour oxyder 1μmol de SGZ par minute. Nous n’avons pas constaté de variation significative au cours du temps et des lots de ces activités.
III.2. Etude rhéologique
La réaction de gélification a été réalisée in situ dans le rhéomètre Discovery HR-2 de TA Instrument (UK). Ce dernier nous a permis de suivre la cinétique de la formation de l’hydrogel en mesurant les modules de conservation (G’) et de perte (G’’) en fonction du temps et de déterminer leurs propriétés mécaniques finales. Une fréquence de 1Hz et une déformation de 2% ont été imposées (domaine viscoélastique linéaire). Les mesures ont été reproduites en
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trois exemplaires et ont montré une bonne reproductibilité. Le Tableau B-1 présente un exemple de reproductibilité dans le cas des dérivés HA-FA.
Tableau B-1 : Exemple de test de reproductibilité de l’étude rhéologique de la réaction de gélification dans le cas des dérivés HA-FA
Produit G’(t=70 min) (Pa) G’moy (t=70 min) (Pa) G’’(t=70 min) (Pa) G’’moy (t=70 min) (Pa)
tgel (min) tgel moy
(min) HA-FA 99 93,7 ± 5,4% 0,82 0,87 ± 9,5% 2,3 2,1 ± 11% HA-FA bis 93 0,83 2,15 HA-FA tris 89 0,97 1,85
III.2.1. Hydrogels biomimétiques par voie enzymatique
Dans le cas des dérivés de pullulane greffé acide férulique (PUL-FA), trois concentrations (40,70 et 100 g/L) ont été préparées dans le tampon citrate/phosphate (0,1M, pH=5,5) à température ambiante. Une solution concentrée (1g/L) de laccase Trametes
versicolor a été également préparée dans le même milieu. Cette solution a été ensuite diluée
pour obtenir 3 concentrations différentes qui permettent ensuite d’avoir après ajout dans la solution de PUL-FA, 3 activités en enzyme (0,5 ; 1 et 2 nkat). Le mélange (PUL-FA + laccase) est réalisé manuellement (environ 1 à 2 min). Il est introduit immédiatement après dans la géométrie ‘doubles-cylindres concentriques’ du rhéomètre. Le temps écoulé pendant l’agitation manuelle et l’introduction de la solution dans la géométrie du rhéomètre a été pris en compte dans le tracé des courbes de G’, G’’, η* et tan δ en fonction du temps.
Cette même procédure a été utilisée pour la gélification des CMP-FA greffé acide férulique mais à une concentration de 20 g/L et une activé enzymatique de 0,2 ; 1 et 2 nkat en laccase de Pleurotus ostreatus.
Pour les dérivés HA-FA, une géométrie cône-plan (4 cm, angle 2°) a été utilisée en raison de la plus forte viscosité du HA. Selon la masse molaire du HA, nous avons travaillé à 5 ; 10 et 15g/L. La solution de HA-FA est versée et étalée sur le plateau du rhéomètre à laquelle un petit volume d’une solution de laccase est ajouté directement pour avoir une activité de 0,1 ; 0,2 ou 1 nkat. La mesure est déclenchée après environ 40 secondes (temps de la baisse de la géométrie). Ce temps a été pris en compte dans les mesures rhéologiques.
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III.2.2. Hydrogels obtenus par photoréticulation
Pour suivre la cinétique de la formation des hydrogels obtenus par photoréticulation, le rhéomètre avec une géométrie cône-plan spécifique (2 cm, angle 2°, gap 57 µm) a été relié à une photodiode UV de longueur d’onde entre 320 et 500 nm avec un pic primaire à 365 nm (UV Light Guide Accessory TA Instrument, UK). Le plan est en quartz permettant l’illumination de la solution par le dessous (Figure B-14-A). Un même protocole a été utilisé pour les dérivés du CMP et du HA modifiés amine/acide gras insaturé. Elle consiste à préparer à température ambiante une solution de 50 g/L dans le cas du CMP modifié et de 25 g/L dans le cas du HA modifié dans l’eau milli-Q à laquelle une solution de Darocur 1173 (photoamorceur) (Figure B-14-B) est ajoutée de façon à obtenir une concentration de 15g/L de Darocur dans la solution finale. Le mélange est vigoureusement agité pendant 30 s et introduit ensuite sur la géométrie plane du rhéomètre. La mesure est ainsi déclenchée et après 2 min, une irradiation à l’intensité de 70 mW/cm2 pendant 3 min a été exercée déclenchant ainsi la photoréticulation et par conséquent le début de la gélification.
Figure B-14 : A) Rhéomètre Discovery HR-2 lié à une source UV (UV Light Guide Accessory) pour l’étude rhéologique in situ de la gélification par photoréticulation.
B) Structure du Darocur 1173
III.3. Propriétés de gonflement
Faute de temps, lors de ce travail de thèse, nous avons pu évaluer uniquement les propriétés de gonflement des hydrogels biomimétiques obtenus par voie enzymatique.
Le protocole d’élaboration de ces hydrogels a été décrit dans la partie III.2.1. La seule différence se situe au niveau des volumes afin d’obtenir suffisamment de matière hydrogel pour réaliser les études de gonflement et au niveau du temps de réaction de la réticulation qui a été
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fixé à 24h. Les hydrogels obtenus ont été soigneusement lavés à l’eau milli-Q pour éliminer le sel et l’enzyme, congelés puis lyophilisés pendant 1 semaine. Pour la cinétique de gonflement, une masse connue exactement d’hydrogel sec a été immergée dans 20 mL d’eau milli-Q à température ambiante et à pression atmosphérique jusqu’à atteindre l’équilibre de gonflement. La prise en eau a été suivie pendant la phase de gonflement où à chaque temps t, l’hydrogel est retiré de la solution et est pesé après l’élimination de l’excès d’eau par des lingettes pour tâches délicates (Kimtech). Le taux de gonflement d’hydrogel a été calculé à chaque temps de mesure par la relation suivante :
𝑄 =𝑚 − 𝑚0
𝑚0 (Eq. B30)
avec 𝑚 la masse de l’hydrogel à l’instant t 𝑒𝑡 𝑚0 la masse de l’hydrogel sec avant le gonflement.
Les conditions de synthèse des hydrogels à partir des 3 polysaccharides greffés FA ainsi que les conditions de mesure des gonflements sont récapitulées dans le Tableau B-2.
Tableau B-2 : Récapitulatif des conditions de synthèse et de mesures de gonflements des différents hydrogels
Produit Concentration en polysaccharide (g/L)
Activité enzymatique (nkat)
Milieu d’étude
PUL-FA 40 – 70 – 100 0,5 – 1 – 2 Eau milli-Q
CMP-FA 20 2 Eau milli-Q
Tampon citrate/phosphate (0,1mol/L, pH=5,5)
NaCl 0,15 mol/L
HA-FA 5 – 10 – 15 0,1 – 0,2 – 1 Eau milli-Q
NaCl 2 mol//L HCl (pH = 2) HCl (pH = 4)
Chaque expérience de gonflement a été réalisée trois fois pour donner la valeur moyenne qui est peu éloignée des trois mesures (bonne répétabilité).
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