Chapitre III : Caractérisation fonctionnelle et structurale de polysaccharidases de R. baltica
III. B.4 - Modélisation de la structure du module GH33 de RB3006 à partir de la sialidase NedA
Un modèle structural du module catalytique GH33 de RB3006 a été généré par homologie à partir de la structure de NanH de M. viridifaciens en complexe avec son inhibiteur Neu5Ac2en (structure de code PDB 1EUS). En effet, ces deux protéines possèdent une bonne similitude sur la longueur de leur séquence (39 % pour une identité de 25 %) et l’alignement généré à partir des séquences de ces deux protéines fait apparaître un taux assez faible d’insertions et de délétions, de plus dans des zones non adjacentes au site actif, ce qui est crucial pour l’élaboration d’un modèle valide (voir Figure III-74)
Une explication plus détaillée des critères importants dans le choix d’une bonne référence pour la modélisation des structures par homologie est donnée dans la partie I.B.4 de ce chapitre. Le modèle a été généré avec le service de modélisation du centre EBI (plateforme SwissModel) accessible via le logiciel DeepView / Swiss-PDBViewer v4.0. Ce service de modélisation peut produire des modèles structuraux par homologie à partir d’un alignement de séquence et d’un fichier de coordonnées atomiques.
Longueur d’onde (nm)
Intensité de l’emission (Unités arbitraire
s
Figure III-74 : Alignement des GH33 de NanH et RB3006.
Alignement du domaine catalytique GH33 de NanH avec celui de RB3006. Les résidus
catalytiques sont matérialisés par des triangles rouges (▲). L’acide aspartique stabilisant
potentiellement le donneur de proton est matérialisé par un triangle orange (▲). Les
triangles verts (▲) marquent un motif décrit à la fin de cette section. Les motifs Asp-box
sont matérialisés par des encadrés bleus. Figure extraite de ESPript après alignement avec Multalign (et affinement à la main)
Le modèle semble raisonnablement fiable : il présente un RMSD de 0,53 Ǻ vis-à-vis de la structure de NanH (calcul réalisé avec DeepView sur les carbones Cα). Comme expliqué dans la partie I-B-4, un modèle reste cependant une hypothèse de travail, tout ce qui suit est donc bien évidemment sujet à caution. D’autres facteurs corroborent la validité du modèle. En effet, nombre de résidus du cœur hydrophobe sont conservé, avec en particulier beaucoup de résidus aromatiques. De plus, les résidus chargés à la surface du modèle ainsi que ceux répartis le long de la séquence se superposent également à ceux de NanH. Enfin, les motifs Asp-box se positionnent sans générer de conflit stérique.
Figure III-75 : Modèle du module catalytique GH33 de RB3006.
Présentation du modèle du module catalytique GH33 de RB3006. a) et b) Vues à 90° de la superposition du modèle de RB3006 (bleu) et de 1EUR (rouge).
La figure suivante met en évidence les divergences et conservations proposées pour le module catalytique de RB3006 par rapport à 1EUR. La Figure III-77 présente le site actif du module GH33 de RB3006 avec l’adoption d’un code couleur selon la conservation des résidus par rapport à 1EUR (Tableau III-20).
a) b)
Figure III-76 : Motifs SxDxxTW. Représentation des cinq séquences conservées SxDxxTW appartenant aux motifs Asp-box propres aux sialidases de la famille GH33.
Tableau III-20 : Sites de fixation au substrat de RB3006 (GH33). Présentation des acides aminés probablement impliqués dans la liaison du substrat dans le module catalytique GH33 de RB3006, classés en
fonction de leur niveau d’identité avec leur référence structurale. 1 : Ces
résidus se superposent quasi-parfaitement avec ceux de 1EUR ; 2 : Ces
résidus ne sont pas superposés à leur homologue de 1EUR mais
appartiennent à des boucles flexibles ; 3 : résidus catalytiques
Figure III-77 : Modèle du site actif de RB3006 (GH33).
Représentation stéréoscopique des acides aminés proposés à la fixation du substrat dans le module catalytique GH33 de RB3006. Le code couleur adopté correspond à celui du Tableau III-20. L’inhibiteur Neu5Ac2en présent dans la structure de 1EUS est ajouté (en blanc) à titre indicatif.
Un dernier élément dans ce modèle semble pointer vers une singularité de la protéine de R. baltica. En effet, ce modèle a permis de constater la présence de deux cystéines (C320 et C336) relativement proches, qui ne sont pas conservées dans la famille (voir positions marquées d’un triangle vert -▲- dans la Figure III-74). Elles ne sont pas assez proches dans le modèle pour impliquer un pont disulfure mais elles le sont suffisamment dans la structure et à des positions suffisamment remarquables (extrémités de brins β adjacents) pour indiquer que la structure réelle de RB3006 possède probablement un pont disulfure à cette position. Ce pont disulfure se trouve lui-même à une position assez particulière puisqu’il serait adjacent à la tyrosine catalytique, engendrant au minimum une stabilisation de cette dernière (Figure III-78).
Figure III-78 : Vue stéréoscopique du modèle du site actif de RB3006 (GH33). Vue stéréoscopique du site actif de RB3006 mettant en évidence la présence d’un pont disulfure probable entre les cystéines C320 et C336. Les trois résidus impliqués dans la catalyse sont représentés en vert. L’inhibiteur Neu5Ac2en présent dans la structure de 1EUS est ajouté (en blanc) à titre indicatif.
III.C - Cristallogénèse
Les tests de cristallisation ont été réalisés pour une concentration en enzyme d’environ 8 mg/mL pour le module catalytique et 5 mg/mL pour le module UNK1 (estimations réalisées après mesure sur NanoDrop sur 2µL d’échantillon). Comme pour RB2160, 672 conditions de cristallisation ont été testées, via 5 plaques Corning de 96 conditions issues des kits commerciaux suivants : PEG Screen I, PEG Screen II, the
Cations, PACT Suite, JCSG+, MDL I et MDL II. Les plaques ont été rempli avec un robot qui dispense des nano-gouttes assises. Ainsi 300 nL de protéines ont été mélangés avec 150 nL de solution de réservoir et ont été mis à équilibrer contre 100 µL de solution de réservoir.
Les résultats ont globalement été assez comparables à ceux obtenus avec RB2160 : sur l’ensemble des conditions, quelques unes ont données des précipités microcristallins intéressants sans cependant qu’une tendance globale ne se dégage. Des purifications avec un tampon final légèrement différent (concentration plus faible de NaCl) ont également été testées mais n’ont permis d’identifier des conditions de cristallisation plus claire. A noter cependant qu’une vérification récente des boites de cristallogénèse du module UNK1 a révélé la croissance d’un petit cristal (par observation à la loupe binoculaire avec lentille réfringente). Cet objet ayant probablement grandi au cours des douze derniers mois, ce cristal fera prochainement l’objet d’une étude par spectrométrie de masse afin de vérifier si il ne s’agirait pas d’une version tronquée de la protéine, permettant une croissance cristalline sans une zone flanquante qui perturbait l’empilement cristallin au point d’inhiber la cristallisation. Ce module est après tout le seul de l’ensemble des cibles finales dont les délimitations ont été déterminés seulement par analyse bioinformatique, et il n’est pas impensable que ce type de séquence flanquante puisse exister.