Mesure du stress oxydatif induit par les UVA dans les cellules HaCaT traitées par le PD98059

ERK est la voie mitogénique majeure initiée par l’activation de l’EGFR (Blenis, 1993; Marshall, 1995) et est impliqué dans la régulation de la production d’ERO intracellulaire induite par l’EGF (Oh et al., 2010). Par conséquent, nous avons ensuite traité les cellules HaCaT avec un inhibiteur spécifique de ERK, le PD98059.

Les cellules HaCaT sauvages, HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et HaCaT-R151C clone 30 ont été traitées 1 heure avec 20 µM de PD98059 et ont été exposées à une irradiation UVA de 9 J/cm2. Immédiatement après l’irradiation, la production d’ERO intracellulaire a été quantifiée en mesurant la fluorescence du produit d’oxydation du carboxy-H2DCF-DA par cytométrie en flux. Les résultats sont présentés Figure 70.

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Figure 70 : Production d’ERO intracellulaire induite par les UVA dans les cellules HaCaT traitées par le PD98059. Les cellules HaCaT wt (en noir), les cellules HaCaT-MC1R (clones 35 et 53, en vert et rouge respectivement) et les cellules HaCaT-R151C (clone 30, en bleu) sont traitées pendant 1 heure avec 20 µM de PD98059 puis sont exposées à une dose d’UVA de 9 J/cm2. En parallèle, un contrôle non irradié ainsi qu’un contrôle non traité par le PD98059 sont réalisés (contrôles négatifs). La production d’ERO intracellulaire est déterminée immédiatement après irradiation en mesurant la fluorescence du produit d’oxydation du carboxy-H2DCF-DA (10 µM, 1 heure) par cytométrie en flux. Grâce au marquage IP (5 µg/ml), nous avons discriminé la population morte de la population vivante. A partir des différentes moyennes de fluorescence obtenues, la production d’ERO a été calculée par rapport aux cellules HaCaT non irradiées et non traitées par le PD98059 qui sont normalisées à 1. Les données indiquées correspondent à la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes (test t de Student par rapport aux cellules HaCaT non traitées par le PD98059 – comparaison des moyennes – différence significative à 99% si p<0,01**).

Le PD98059 ne modifie pas le stress oxydatif induit par les UVA dans les cellules HaCaT sauvages et dans les cellules HaCaT-R151C (clone 30).

Dans le cas des cellules HaCaT surexprimant un récepteur MC1R fonctionnel (clones 35 et 53), nous observons une augmentation de la production d’ERO intracellulaire quand ces cellules sont traitées par un inhibiteur de ERK et irradiées par 9 J/cm2 d’UVA. En effet, la production d’ERO intracellulaire augmente de 240% dans les cellules HaCaT-MC1R clone 35 et de 151% dans les cellules HaCaT-MC1R clone 53 (Tableau 17).

Page 173 % activation Dose UVA (J/cm2) 9 HaCaT-MC1R 35 240 ± 58%** HaCaT-MC1R 53 151 ± 15%**

Tableau 17: Activation de la production d’ERO intracellulaire induite par les UVA après stimulation par le PD98059 dans les cellules HaCaT-MC1R. Les % d’activation sont calculés par rapport aux cellules HaCaT irradiées et non traitées par le PD98059.

L’inhibition de ERK restaure la production d’ERO intracellulaire induite par les UVA dans les cellules HaCaT qui surexpriment un récepteur MC1R fonctionnel mais pas dans les cellules HaCaT sauvages et dans le variant non fonctionnel R151C.

Ces résultats suggèrent que la régulation du stress oxydatif induit par les UVA dans les cellules HaCaT pourrait être liée à des transactivations entre le récepteur MC1R et la voie de signalisation EGFR/ERK (Stork and Schmitt, 2002).

III.2. L’inhibition de l’EGFR et de ERK diminue la production

d’AMPc induite par l’α-MSH dans les cellules HaCaT-MC1R

De nombreux exemples de transactivations entre les RCPG et l’EGFR ont été décrits et les mécanismes régulant ces interactions dépendent à la fois du RCPG et du type cellulaire (Rozengurt, 2007). Par exemple, les RCPG peuvent transactiver l’EGFR via des voies de signalisation intracellulaires impliquant la voie AMPc/PKA (Barbier et al., 1999; Drube et al., 2006; Gerits et al., 2008).

Nous avons mesuré les niveaux d’AMPc intracellulaires dans les cellules HaCaT sauvages, HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et HaCaT-R151C clone 30 stimulées par l’α-MSH seule ou en présence d’un inhibiteur de l’EGFR (PD153035) ou d’un inhibiteur de ERK (PD98059) (Figure 71).

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Figure 71 : Mesure de la production d’AMPc intracellulaire induite par l’α-MSH dans les cellules HaCaT traitées par le PD153035 et par le PD98059. Les cellules HaCaT wt (en noir), les cellules HaCaT-MC1R (clones 35 et 53, en vert et rouge respectivement) et les cellules HaCaT-R151C clone 30 (en bleu) sont stimulées pendant 1 heure par l’α-MSH (1 µM) seule ou en présence de PD153035 (0,5 µM) ou de PD98059 (20 µM) puis la concentration d’AMPc intracellulaire est déterminée à l’aide d’un kit AMPc LANCE (PerkinElmer Life Science Inc.) comme décrit dans la partie Matériels & Méthodes (paragraphe II.1.4). Les données indiquées correspondent à la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes (test t de Student par rapport aux cellules HaCaT stimulées par l’α-MSH seule – comparaison des moyennes – différence significative à 95% si p<0,05*).

Comme nous avions pu le mettre en évidence précédemment, l’α-MSH augmente les niveaux d’AMPc intracellulaires dans les cellules HaCaT-MC1R (cf. partie 1 des résultats paragraphe IV). En revanche, les cellules HaCaT sauvages et HaCaT-R151C ne présentent pas d’induction de la production d’AMPc intracellulaire lorsqu’elles sont stimulées par l’α-MSH.

Le traitement des cellules par le PD153035 (inhibiteur de l’EGFR) et par le PD98059 (inhibiteur de ERK) réduit de manière significative la production d’AMPc intracellulaire induite par l’α-MSH dans les cellules HaCaT exprimant un récepteur MC1R fonctionnel (Figure 71), suggérant donc qu’il existe un lien étroit entre le récepteur MC1R et la voie de l’EGFR/ERK.

Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons réalisé la même expérience en présence de forskoline, un activateur de l’adénylate cyclase (Figure 72).

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Figure 72 : Mesure de la production d’AMPc intracellulaire induite par la forskoline dans les cellules HaCaT traitées par le PD153035 et par le PD98059. Les cellules HaCaT wt (en noir), les cellules HaCaT-MC1R (clones 35 et 53, en vert et rouge respectivement) et les cellules HaCaT-R151C clone 30 (en bleu) sont traitées pendant 1 heure par l’IBMX (1 mM) puis sont stimulées par la forskoline (10 µM) seule ou en présence de PD153035 (0,5 µM) ou de PD98059 (20 µM). La concentration d’AMPc intracellulaire est déterminée à l’aide d’un kit AMPc LANCE (PerkinElmer Life Science Inc.) comme décrit dans la partie Matériels & Méthodes (paragraphe II.1.4). Les données indiquées correspondent à la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes.

D’après les résultats obtenus, nous pouvons observer que l’inhibition de l’EGFR ainsi que celle de ERK n’ont aucun effet sur la production d’AMPc intracellulaire induite par la forskoline.

DISCUSSION