Le récepteur MC1R est fortement exprimé dans les mélanocytes (Roberts et al., 2006) mais on le retrouve également dans d’autres types cellulaires comme les monocytes (Bhardwaj et al., 1997; Rajora et al., 1996), les cellules endothéliales (Hartmeyer et al., 1997) et les fibroblastes dermiques (Boston and Cone, 1996). Il a été mis en évidence que les UV augmentaient l’expression du récepteur MC1R dans les mélanomes (Bolognia et al., 1989; Chakraborty et al., 1991; Eberle et al., 1993; Eller et
al., 1996; Siegrist et al., 1989; Siegrist et al., 1994) et dans les mélanocytes humains
normaux (De Luca et al., 1993; Donatien et al., 1992; Funasaka et al., 1998; Scott et al., 2002).
L’expression du MC1R peut être induite par les UV (Scott et al., 2002), par les mélanocortines (Garcia-Borron et al., 2005; Suzuki et al., 1996) ou après différenciation par du Ca2+ (Chakraborty et al., 1999). Néanmoins, des travaux récents n’ont pas mis en évidence une expression du MC1R dans les cellules HaCaT (Roberts et al., 2006). De plus, la production d’AMPc intracellulaire n’est pas augmentée après stimulation par la NDP-MSH dans les kératinocytes et dans les fibroblastes alors qu’une forte induction est observée dans les lignées mélanocytaires (Roberts et al., 2006). Des résultats contradictoires sur les kératinocytes et sur les fibroblastes ont été observés. Les travaux de Donatien et al. et ceux de Suzuki et al. n’ont pas mis en évidence de liaison de l’agoniste dans ces types cellulaires (Donatien et al., 1992; Suzuki et al., 1996) alors que d’autres études ont montré qu’une liaison spécifique pouvait être établie dans ces cellules (Bohm and Luger, 2004; Chakraborty et al., 1999; Funasaka et al., 2001). Néanmoins, les UVB stimulent l’expression du MC1R dans les kératinocytes humains normaux in vitro (Chakraborty et al., 1999; Garcin et al., 2009) et dans l’épiderme humain in vivo (Schiller et al., 2004).
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I. CHOIX DU MODÈLE CELLULAIRE
Les kératinocytes représentent 90% des cellules de l’épiderme et sont fortement soumis à l’exposition au rayonnement UV.
La lignée cellulaire HaCaT a été mise au point par l’équipe du Dr Fusenig en 1988 (Boukamp et al., 1988). Cette lignée cellulaire dérive de la culture primaire à long-terme de kératinocytes cutanés humains. Ces cellules sont considérées immortelles, possèdent des marqueurs chromosomiques spécifiques stables mais ne sont pas tumorigènes. Même après plusieurs passages, les cellules HaCaT conservent une remarquable capacité à se différencier normalement. Ces cellules ont été obtenues après excision chirurgicale de peau humaine située à la périphérie d’un mélanome localisé dans le dos. Cette lignée cellulaire a été développée après une culture prolongée à température élevée et en présence de faibles concentrations de Ca2+ (Boukamp et al., 1988).
Contrairement aux cellules humaines transformées à l’aide de virus, les cellules HaCaT, bien qu’immortelles, conservent largement leur capacité à restituer un épiderme structuré après transplantation in vivo. L’immortalisation a été causée par l’inactivation du gène p53 par mutations des deux allèles par les UV. Malgré cela, les cellules HaCaT restent relativement proches de kératinocytes humains normaux et offrent ainsi un modèle d’étude in vitro intéressant dans les travaux portant sur la photobiologie cutanée (Fusenig and Boukamp, 1998).
Nous avons donc mis au point un modèle expérimental pour étudier in vitro le rôle du récepteur MC1R dans les mécanismes oxydatifs induits par les UV. Ce modèle repose sur la transfection stable de kératinocytes immortalisés humains HaCaT par le gène codant pour la forme sauvage du MC1R et par un gène MC1R muté (R151C). Le variant R151C se caractérise par une mutation au niveau d’un acide aminé. L’arginine 151 est remplacée par une cystéine au niveau de la boucle intracellulaire n°2 du récepteur ce qui abolit son activité (Garcia-Borron et al., 2005). Les sujets porteurs de ces mutations ont un phénotype cheveux roux/peaux claires appelé RHC (cf. partie 2 de la synthèse bibliographique). L’obtention de ces différentes lignées cellulaires a fait partie du travail de thèse de Geneviève Garcin (Garcin, 2007) et le protocole d’obtention des différents clones est décrit dans la partie Matériels & Méthodes, paragraphe I de ce mémoire.
Page 115 Au cours de ce travail de thèse, nous avons utilisé les cellules HaCaT sauvages (HaCaT wt), les cellules exprimant la forme sauvage du gène MC1R (HaCaT-MC1R) et celles exprimant le gène MC1R muté (HaCaT-R151C).
II. ETUDE DE L’EXPRESSION DU MC1R
L’expression des récepteurs MC1R dans les cellules HaCaT transfectées a été montrée par PCR quantitative en temps réel (qPCR). La méthodologie employée est décrite dans la partie Matériels & Méthodes, paragraphe III de ce mémoire. Le niveau d’expression du MC1R a été mesuré dans les cellules HaCaT non transfectées (HaCaT wt), dans deux clones différents de cellules HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et dans deux clones différents de cellules HaCaT-R151C (clones 15 et 30). Les résultats de la qPCR sont présentés Figure 41.
Figure 41 : Expression stable du récepteur MC1R et du variant non fonctionnel R151C dans les cellules HaCaT. L’expression du gène MC1R est déterminé par qPCR en utilisant des primers spécifiques (sens : TGTCGTCTTCAGCACGCTCTT ; anti-sens : CGTACAGCACGGCCATGA). Les données sont normalisées par rapport à la β-actine.
Page 116 Le niveau d’expression du MC1R, observé après 40 cycles d’amplification, est environ 40 et 80 fois plus élevé dans les clones 35 et 53 respectivement, par rapport aux cellules HaCaT sauvages. De manière similaire, le niveau d’expression du récepteur MC1R est 25 et 85 fois plus élevé dans les clones 15 et 30 respectivement, par rapport aux cellules HaCaT sauvages.
La quantification a été réalisée à l’aide d’un gène domestique exprimé de façon ubiquitaire dans tous les types cellulaires, la β-actine.
III. PROPRIETES DE LIAISON DE L’Α-MSH POUR LE RECEPTEUR
MC1R
Les propriétés fonctionnelles des cellules HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et des cellules HaCaT-R151C (clone 30) ont été étudiées par un test de liaison par compétition en présence d’un ligand radiomarqué, la [125I]-NDP-MSH. Ce radioligand est un analogue de l’α-MSH couramment utilisé dans ce type de technique. Les cellules HaCaT sauvages sont utilisées comme contrôle négatif (Figure 42).
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Figure 42 : Déplacement de la [125I]-NDP-MSH par l’α-MSH sur cellules entières de la lignée HaCaT. Les cellules HaCaT wt, HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et HaCaT-R151C (clone 30) sont incubées deux heures à 37°C en présence de 100.000 cpm de [125I]-NDP-MSH et de concentrations croissantes d’α-MSH comprises entre 10-11 et 10-6 M. Le pourcentage de radioligand lié spécifiquement a été calculé de la façon suivante : % radioligand lié de manière spécifique = [100 × (échantillon–liaison non spécifique)]/(liaison totale–liaison non spécifique). IC50 (clone 30) = 1,89 nM ; IC50 (clone 35) = 1,26 nM et IC50 (clone 53) = 1,43 nM.
Les résultats obtenus sont en accord avec ceux de Roberts et al. (Roberts et al., 2006). Nous n’observons pas de liaison spécifique de la [125I]-NDP-MSH dans les cellules HaCaT sauvages. Les cellules HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et les cellules HaCaT-R151C (clone 30) montrent une cinétique de liaison spécifique et saturable en présence de [125I]-NDP-MSH. De plus, l’affinité du radioligand pour le récepteur MC1R est similaire dans toutes les cellules transfectées avec des IC50 de 1,26 nM et de 1,43 nM dans les cellules HaCaT-MC1R (clones 35 et 53 respectivement) et de 1,89 nM dans les cellules HaCaT-R151C (clone 30).
Par conséquent, la mutation non fonctionnelle R151C du récepteur MC1R n’affecte pas la liaison de l’α-MSH pour le récepteur. Ces résultats sont concordants puisque la mutation R151C affecte la boucle intracellulaire n°2 du récepteur (Garcia-Borron et al., 2005) et n’a donc pas d’effet sur la liaison de l’α-MSH au MC1R.
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IV. PRODUCTION D’AMPC INTRACELLULAIRE DANS LES CELLULES
HaCaT
IV.1.Couplage fonctionnel
La production d’AMPc constitue l’un des premiers événements consécutifs à la liaison de l’α-MSH au récepteur MC1R. Elle résulte du couplage fonctionnel entre les protéines G hétérotrimériques et le MC1R, suivi de l’activation de l’adénylate cyclase. La mesure de la production d’AMPc permet de vérifier l’activation du récepteur mais pas les fonctions biologiques qui lui sont associées. A ces fins, nous avons mesuré la production d’AMPc intracellulaire dans les cellules HaCaT sauvages, HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et HaCaT-R151C (clones 15 et 30) après stimulation par des concentrations croissantes d’α-MSH comprises entre 10-6 et 10-11 M. En parallèle, nous avons incubé les cellules HaCaT en présence de forskoline, un activateur de l’adénylate cyclase, qui nous a servi de contrôle positif. Les résultats sont présentés Figure 43.
Figure 43 : Couplage fonctionnel des récepteurs MC1R et R151C dans les cellules HaCaT. Les cellules HaCaT wt, HaCaT-MC1R (clones 35 et 53) et HaCaT-R151C (clones 15 et 30) sont incubées 1 heure à 37°C avec des concentrations croissantes d’α-MSH comprises entre 10-6 et 10 -11 M. En parallèle, les cellules HaCaT sont incubées avec de la forskoline, un activateur de l’adénylate cyclase (contrôle positif). La quantité d’AMPc accumulée dans les cellules est mesurée par un kit de quantification RIA (PerkinElmer Life Science Inc.).
Page 119 L’augmentation de la concentration intracellulaire d’AMPc dans les cellules HaCaT-MC1R, incubées en présence d’α-MSH, indique que ces cellules expriment les protéines GαS nécessaires au couplage avec le MC1R et que ce couplage est fonctionnel. La production maximale d’AMPc est obtenue pour des concentrations en α-MSH supérieures ou égales à 10-9 M.
Les résultats montrent également que la stimulation des cellules HaCaT sauvages avec l’α-MSH n’entraîne pas de production d’AMPc intracellulaire, quelle que soit la concentration en agoniste utilisée. Concernant les cellules HaCaT-R151C, nous avons vu précédemment (Figure 42) que la liaison de l’α-MSH sur le récepteur MC1R n’était pas affectée. Par contre, nous n’observons pas de production d’AMPc intracellulaire après stimulation par des concentrations d’α-MSH de 10-11 et 10-9 M. Pour des concentrations d’α-MSH plus élevées (10-6 M), on observe une production d’AMPc intracellulaire plus importante comparé aux cellules HaCaT sauvages mais cette production reste bien inférieure à celle obtenue dans les cellules HaCaT-MC1R.
Par conséquent, la mutation non fonctionnelle R151C affecte le couplage fonctionnel du récepteur MC1R.
IV.2.Activité constitutive du MC1R
Les mélanocytes et les mélanomes en culture expriment un nombre faible de molécules de MC1R avec environ 1.000 sites de liaison à l’α-MSH par cellule (Ghanem et
al., 1988; Siegrist et al., 1989). A l’inverse, les cultures primaires de mélanocytes murins
expriment plus de 100.000 sites par cellule. Il est généralement admis que cette différence est compensée par une forte affinité du récepteur MC1R pour l’ACTH et l’α-MSH et par une absence de désensibilisation du récepteur après liaison de ces ligands (Mountjoy et al., 1992). Une autre hypothèse consiste en une hyperactivité ou une forte activité constitutive basale du récepteur MC1R. En effet, l’activité constitutive basale est relativement fréquente dans les RCPG (Bond and Ijzerman, 2006; Costa and Cotecchia, 2005; Costa and Herz, 1989; Cotecchia, 2007; Milligan, 2003; Sanchez-Mas et al., 2004).
Page 120 De plus, certaines données suggèrent que le degré d’activation constitutive du MC1R pourrait jouer un rôle important sur le plan physiologique (Adan, 2006; Garcin, 2007; Garcin et al., 2009; Sanchez-Mas et al., 2004).
Les travaux de thèse de Geneviève Garcin ont mis en évidence une accumulation d’AMPc dans les cellules HaCaT-MC1R, indépendamment de toute stimulation par l’α-MSH. En revanche, les cellules HaCaT-R151C ne présentent pas de production d’AMPc basale (Garcin, 2007; Garcin et al., 2009). Ces résultats sont en accord avec ceux publiés par Sanchez-Mas et al. et indiquent une activité constitutive du MC1R dans les cellules HaCaT-MC1R (Sanchez-Mas et al., 2004).
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