Mesure des paramètres de la réplication par la technique de « DNA spreading »

Cette technique consiste en un traitement des cellules par successivement 2 analogues de bases couplés à un fluorophore, CldU puis IdU, durant un temps déterminé (ici, 20minutes par analogue). Les cellules en phase réplicative au moment du traitement incorporent ces analogues au cours de la synthèse de l’ADN. Les cellules sont ensuite lysées, puis un étalement des fibres d’ADN est réalisé, suivi d’une immunodétection des analogues de base, afin de mesurer la vitesse de progression au niveau des fourches de réplication par microscopie en quantifiant la longueur des pistes, ou tracks, colorées. Cette technique a été réalisée sur des cellules leucémiques primaires récupérées après 7 jours de culture dans un milieu semi-solide. Avant l’étape d’incorporation des analogues nucléotidiques, ces cellules primaires sont lavées et sont de nouveau traitées 2h dans un milieu liquide (IMDM).

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C. Résultats

J’ai dans un premier temps étudié le niveau d’expression de Chk1, au niveau protéique, sur 10 échantillons issus de la cohorte utilisée pour l’analyse fluidigm. Il apparait que les niveaux d’expression de l’ARNm, obtenus grâce à l’analyse fluidigm, et de la protéine Chk1 sont corrélés positivement (Figure 34 A et 34 B) (r²=0.7781, p=0.0105). Ce résultat nous a amené à étudier plus en détail l’impact de l’expression protéique de Chk1 dans des cellules primaires leucémiques, car la forte expression génique de Chk1 est de mauvais pronostic dans les LAM. Pour cela, une nouvelle cohorte de 37 échantillons de patients a été constituée, sur laquelle le niveau d’expression de Chk1 au moment de la décongélation a été évalué et quantifié par immunofluorescence (figure 34 C) et/ou par western-blot (figure 34 D et 34 E). Cette cohorte a pu être divisée en 2 groupes : 15 échantillons ont des niveaux d’expression de Chk1 élevés, ils constituent le groupe « High Chk1 » ou « H Chk1 », et 22 échantillons présentent des niveaux de Chk1 faibles, ils constituent le groupe « Low Chk1 » ou « L Chk1 ».

Nous avons ensuite évalué le niveau d’activation de Chk1 dans ces échantillons à la décongélation, en l’abscence de traitement. Pour cela, nous avons regardé le niveau de phosphorylation sur le résidu sérine 345 et le niveau d’expression de CDC25A, une cible majeure de Chk1 qui, lorsqu’elle est activée par ATR, entraîne sa dégradation. Les données indiquent qu’il n’y a pas de corrélation entre le niveau d’expression de Chk1 et son niveau de phosphorylation par ATR, ni avec le niveau de la phosphatase CDC25A, en condition non traitée (figure 34 F). Ceci suggère que la survie globale dans les LAM est dépendante du niveau d’expression de CHEK1, mais n’est pas liée à une activation chronique du point de contrôle de la réponse aux dommages de l’ADN.

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Figure 34 : Le niveau d’expression protéique de Chk1 est corrélé au niveau d’expression de l’ARNm et est hétérogène entre les échantillons de patients atteints de LAM.

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En parallèle de l’évaluation du niveau d’expression de Chk1 au sein des échantillons de patient, j’ai évalué leur niveau de sensibilité à un traitement génotoxique par l’AraC par des tests de clonogénie dans des conditions non traitées, ou traitées avec de l’AraC à 5nM ou 10nM. L’analyse des résultats de ces expériences montre que les cellules des échantillons du groupe « H Chk1 » sont significativement plus résistantes au traitement par l’AraC que les cellules des échantillons du groupe « L Chk1 » (p=0.0242 et p=0.0173 pour les conditions avec 5nM et 10 nM d’AraC respectivement) (Figure 35 A).

Afin de déterminer si la résistance accrue des échantillons « H Chk1 » est bien liée aux fonctions de la kinase, un inhibiteur de Chk1, le SCH900776, a été ajouté en combinaison avec l’AraC dans ces échantillons, à une concentration de 250nM. La présence de cet inhibiteur restaure un niveau de sensibilité de ces cellules leucémiques équivalent à celui des cellules du groupe « L Chk1 » traitées par l’AraC seule (p=0.0398) (figure 35 A). Ces résultats suggèrent l’existence d’un lien direct entre le niveau d’expression de Chk1 et la résistance des cellules leucémiques à un traitement par l’AraC.

Pour comprendre le mécanisme qui pourrait expliquer cette résistance, nous avons émis l’hypothèse que Chk1 permet le maintien de fourches de réplications actives durant le traitement par l’AraC, terminateur de chaine qui entraine des blocages des fourches de réplication. Pour vérifier cette hypothèse, la vitesse de réplication a été mesurée par une technique d’étalement des fibres d’ADN. Cette technique a été réalisée sur des cellules leucémiques primaires récupérées après 7 jours de culture dans un milieu semi-solide, avec les différents traitements (non traité, AraC 5 nM, AraC 5 nM + SCH900776). Des images représentatives des fibres d’ADN marquées des cellules des groupes « L Chk1 » et « H Chk1 » sont présentées en figure 35 B et figure 35 D respectivement. Nous pouvons constater que dans les cellules du groupe « L Chk1 », le traitement par l’AraC entraine une diminution de la longueur des tracks significative (p=0.0018) (Figure 35 C), alors que les cellules du groupe « H Chk1 » ne subissent pas de ralentissement de la vitesse de progression des fourches réplicatives consécutivement au traitement par l’AraC (Figure 35 E). En revanche, l’addition de l’inhibiteur de Chk1 dans le milieu de culture permet de diminuer significativement la longueur des tracks dans les cellules du groupe « H Chk1 » (p<0.0001) (Figure 35 E). Ces données suggèrent que des forts niveaux d’expression de Chk1 facilitent la progression des fourches dans un contexte de stress réplicatif.

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Figure 35: Des niveaux élevés de Chk1 favorisent la résistance des cellules leucémiques au traitement par l’AraC.

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D’autre part, j’ai évalué le potentiel clonogénique des cellules des échantillons des groupes « H Chk1 » et « L Chk1 » indépendamment de tout traitement. Il apparait que la proportion de cellules qui ont la capacité de former des clones, notées CFU-L, est plus importante au sein des échantillons du groupe « H Chk1 » qu’au sein des échantillons du groupe « L Chk1 » (Figure 36 A). De plus, pour chaque échantillon de patient, j’ai pu évaluer quelle taille faisaient la majorité des clones : petite taille (de 5 à 9 cellules), moyenne taille (de 10 à 20 cellules), et grande taille (au-delà de 20 cellules). Cette analyse a permis de montrer que les clones formés sont de plus grande taille dans les échantillons « H Chk1 » que dans les échantillons « L Chk1 » (Figure 38 B). Des images représentatives des clones des différentes tailles sont présentées en Figure 36 C. Ce résultat supporte l’idée que non seulement des forts niveaux de Chk1 cellulaires favorisent la résistance à des traitements par l’AraC, mais aussi favorisent la prolifération cellulaire et potentiellement un phénotype tumoral plus aggressif indépendamment de tout traitement.

Cette prolifération cellulaire exacerbée pourrait être la conséquence de fonctions de Chk1 en faveur de la progression dans le cycle cellulaire, notamment via son rôle transcriptionnel. Ainsi, la kinase CDK1 étant une cible transcriptionnelle connue de Chk1 dont elle favorise l’expression dans des conditions cellulaires non stressées, son niveau d’expresion a été évalué, au niveau de l’ARNm et de la protéine. La figure 36D représente un western-blot représentatif sur lequel nous pouvons constater que le niveau d’expression de CDK1 corrèle au niveau d’expression de Chk1. La quantification de l’expression de CDK1 obtenue par western-blot est présentée sur la figure 36 E. La quantification de l’expression génique meurée par q-RT PCR est présentée sur la figure 36 F. De manière intéressante, l’expression génique et protéique de CDK1 est plus importante dans les cellules du groupe « H Chk1 » que dans les cellules du groupe « L Chk1 », ce qui suggère que Chk1 supporte le potentiel clonogénique des cellules primaires leucémiques en l’abscence de traitement.

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Figure 36: Un niveau d’expression de Chk1 élevé favorise le potential clonogène des cellules leucémiques.

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D. Discussion

Au cours de ce travail, il a été établi qu’au sein d’une cohorte de patients atteints de LAM, le niveau d’expression génique de Chk1 est hétérogène, et un niveau élevé de Chk1 constitue un marqueur de mauvais pronostic en termes de survie globale. De plus, il apparait que dans ces échantillons de cellules primaires, les niveaux d’ARN et protéique de Chk1 sont corrélés, même si cette corrélation n’est pas parfaite, et qu’un fort niveau d’expression de cette kinase favorise le potentiel clonogénique des cellules, indépendamment de tout traitement, mais aussi qu’il favorise la résistance à un traitement à l’AraC ; résistance qui est abrogée lorsqu’un inhibiteur de Chk1 est administré en combinaison avec l’AraC.

Nous avons pu observer une forte hétérogénéité d’expression de Chk1 au niveau génique et protéique, entre les échantillons primaires de patients atteints de LAM. Ce résultat pose la question de la régulation de Chk1 dans ces échantillons. Plusieurs protéines pourraient être à l’origine de la régulation de Chk1 dans les LAM.

Tout d’abord, le facteur de transcription E4F1, qui est important pour la survie cellulaire et la prolifération, a été récemment décrit comme un activateur transcriptionnel de CHEK1. En effet, son invalidation entraîne une diminution des niveaux de CHEK1 (Rodier et al., 2015). E4F1 joue aussi un rôle sur la stabilité de la protéine Chk1 (Grote et al., 2015). Par ailleurs, il apparait que des biopsies de moelle osseuse de patients atteints de LAM ont des niveaux d’expression protéique d’E4F1 élevés par rapport aux biopsies de donneurs sains, et que cette surexrepression favorise la survie des cellules leucémique (Hatchi et al., 2011). Ainsi, nous pouvons nous demander si les niveaux d’expression de Chk1 au niveau ARN et protéique ne sont pas régis, du moins en partie, par le facteur de transcription E4F1 dans les LAM. Des premières expériences menées au laboratoire pour répondre à cette question indiquent que dans les lignées cellulaires leucémiques et dans les échantillons primaires de patient, les niveaux d’expression protéique de Chk1 sont corrélés à ceux d’E4F1. De plus, des immunoprécipitations ont permis de montrer qu’E4F1 et Chk1 co-immunoprécipitent au sein d’un même complexe protéique, et des analyses d’immunofluorescence par Proximity Ligation Assays (PLA) suggèrent également que ces 2 protéines sont proches dans les cellules leucémiques. Enfin, l’invalidation d’E4F1 par shARN entraine une forte diminution de l’expression protéique de Chk1. Ceci nous laisse envisager un rôle majeur d’E4F1 au niveau de la stabilité de Chk1 et de façon étonnante, une forte augmentation de l’expression de l’ARNm

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de Chk1, ce qui va à l’encontre de résultats déjà publiés (Rodier et al., 2015). Ce résultat peut s’expliquer de plusieurs manières : soit E4F1 est un régulateur transcriptionnel négatif de CHEK1 dans notre modèle, soit E4F1 régule l’expression de facteurs de transcription, en particulier p53, ou de miARN capables de réprimer CHEK1. Cette seconde hypothèse s’appuie sur des résultats indiquant qu’E4F1 est capable de mono-ubiquitinyler p53, ce qui favorise son activité transcriptionnelle et donc la répression de l’expression génique de CHEK1 (Bargiela- Iparraguirre et al., 2016; Gottifredi et al., 2001). Par ailleurs, le miR-26 a été identifié comme étant régulé par p53 au niveau transcriptionnel, et capable de réprimer CHEK1 (Lezina et al., 2013). L’invalidation d’E4F1 pourrait donc induire une modification de l’activité transcriptionnelle de p53, une diminution d’expression du miR-26 et donc une perte de la régulation négative de CHEK1.

Un autre régulateur potentiel de Chk1 dans les LAM est la déubiquitynilase USP7 qui a pour substrats des protéines intervenants dans la réponse aux dommages à l’ADN, en particulier la protéine Chk1 qui a été identifiée comme une de ses cibles, dans la lignée d’ostéosarcome U2OS. Cette étude a permis de montrer que la déplétion d’USP7 induit une diminution de l’expression protéique de Chk1, alors que la surexpression d’USP7 induit une augmentation de son expression. La modulation des niveaux de Chk1 passe ici par une stabilisation de cette protéine via sa dé-ubiquitynilation, qui empêche sa dégradation (Alonso-de Vega et al., 2014; Zhang et al., 2014). Il est concevable qu’un mécanisme similaire soit mis en jeu dan les LAM. Des premiers résultats obenus dans l’équipe montrent que comme pour E4F1, les variations des niveaux protéiques d’USP7 sont corrélés aux variations observées pour Chk1 dans les lignées cellulaires leucémiques, et que l’invalidation d’USP7 provoque une diminution du niveau protéique de Chk1. De plus, des expériences d’immunoprécipitation indiquent que ces 2 protéines sont présentes au sein d’un même complexe. Ce résultat laisse supposer qu’USP7 protège effectivement Chk1 de la dégradation. Par ailleurs, l’inhibition d’USP7 dans ces cellules impacte négativement leur viabilité suite à un traitement par l’AraC. Ces résultats sont en accord avec les travaux de la littérature, selon lesquels l’inhibition de USP7 provoque une apoptose cellulaire médiée par la réactivation de p53 (Fan et al., 2013), mais aussi due à l’instauration d’un état de stress oxydant majeur dans ces cellules (Lee et al., 2016). Ce résultat laisse aussi supposer qu’USP7 pourrait protèger Chk1 de la dégradation, notamment lorsqu’elle est activée après des dommages de l’ADN, et favoriser ainsi la survie des cellules leucémiques traitées par l’AraC.

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Nos résultats permettent d’établir une corrélation d’expression protéique entre Chk1 et CDC25A, ce qui semble paradoxal au vu de la littérature qui présente CDC25A comme une cible de Chk1 dans des conditions de dommages de l’ADN, et dont la phosphorylation entraine sa dégradation (Hassepass et al., 2003; Kasahara et al., 2010; Mailand et al., 2000; Sørensen et al., 2003). Dans ce contexte, Chk1 régule négativement la progression dans le cycle cellulaire et limite l’impact du stress réplicatif cellulaire. A l’inverse, CDC25A, s’il n’est pas séquestré ou dégradé, entraine l’instauration d’une instabilité génétique car il stimule la progression des cellules dans le cycle. Ainsi, les cellules ayant des faibles niveaux de Chk1 ou des forts niveaux de CDC25A ont une capacité d’activation des systèmes de détection et de réparation des dommages faible. Elles sont donc particulièrement tributaires de la pleine activité des kinases ATM et surtout ATR pour la mise en place de ces points de contrôle, ce qui explique que ces cellules sont particulièrement sensibles aux inhibiteurs d’ATR (données non publiées ; Ruiz et al., 2016). Cependant, dans nos conditions expérimentales, les cellules ne subissent aucun stress génotoxique, auquel cas Chk1 et CDC25A favorisent toutes les deux la prolifération cellulaire. Les niveaux d’expression de ces 2 protéines au sein d’un échantillon de patient peuvent donc être envisagées comme étant le reflet du niveau de prolifération au sein de cet échantillon.

Par ailleurs, la corrélation d’expression observée entre ces 2 protéines suggère qu’elles pourraient posséder un mécanisme de régulation commun dans les LAM. Ce mécanisme pourrait passer par une régulation post-transcriptionnelle par le microARN miR-16. En effet, ce miR a été décrit comme régulant négativement Chk1 dans les cellules U2OS, en particulier après un stress génotoxique induit par un traitement par la doxorubicine (Lezina et al., 2013). Par ailleurs, miR 16 régule également négativement la phosphatase CDC25A en réponse à des dommages de l’ADN provoqués par un traitement aux rayonnements ultra-violets, dans les cellules Hela et dans des fibroblastes primaires humaines (Pothof et al., 2009). Ainsi, miR-16 pourrait être un régulateur commun de Chk1 et CDC25A dans les LAM, ce qui permettrait d’expliquer que ces protéines varient dans le même sens dans ce contexte. Les premiers résultats que nous avons obtenus sur cette question permettent effectivement de penser que les niveaux d’expression du miR-16 d’un côté, et de Chk1 et CDC25A de l’autre suivent des profils inverses, nous invitant à poursuivre notre étude plus en détail sur le rôle de miR-16 dans la régulation de Chk1 et CDC25A dans les LAM.

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Nos résultats mettent en évidence 2 rôles majeurs et distincts de Chk1 dans les LAM : d’une part elle permet la prolifération cellulaire, en condition non perturbée, et par ailleurs, en condition de stress génotoxique, elle favorise la résistance aux traitements.

La première fonction de Chk1 semble passer par son rôle de régulateur transcriptionnel de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire, notamment de la kinase CDK1, ce qui est en lien avec une fonction de Chk1 déjà décrite dans la littérature (Shimada and Nakanishi, 2008; Shimada et al., 2008). Cependant, il n’est pas exclu que Chk1 supporte en plus la prolifération cellulaire via des fonctions au niveau de la réplication (Guo et al., 2015; Petermann and Caldecott, 2006; Petermann et al., 2006) ou de la mitose (Peddibhotla et al., 2009; Tang et al., 2006b; Yang et al., 2014; Zachos et al., 2007), qui permettent une bonne coordination dans la progression du cycle cellulaire.

La seconde fonction de Chk1 mise en evidence passe par une réponse aux dommages cellulaires causés par l’AraC. L’araC, est un analogue de la cytidine, dont le ribose est remplacé par un arabinose. L’araC est convertie en forme triphosphate dans la cellule et entre en compétition avec la cytidine pour être incorporée lors de la synthèse de l’ADN. Il s’agit d’un antimétabolite dit terminateur de chaine, car une fois incorporé au brin néo-synthétisé, le sucre arabinose entraine un blocage de la réplication par gène stérique. Par ailleurs, l’AraC inhibe l’activité des ADN polymérases, ce qui diminue de manière globale la vitesse de réplication de l’ADN et crée un état de stress réplicatif. Un fort niveau d’expression de Chk1 pourrait donc permettre de contrecarrer cet état de stress réplicatif, en permettant la réparation des dommages de l’ADN, et une reprogrammation du timing de réplication adaptée, comme le suggèrent les résultats de spreading obtenus. Chk1 pourrait aussi limiter l’impact du stress réplicatif en favorisant la réplication trans-lésionnelle (Speroni et al., 2012; Yamada et al., 2013). Cependant, il est à noter que dans les échantillons de patients atteints de LAM, la plus grande majorité des cellules se situe dans la phase G1 du cycle cellulaire (entre 95% et 98% des cellules), et moins de 5% des cellules se retrouvent simultanément en phase S, ce qui ne permet pas d’expliquer l’effet majeur observé lié au traitement par l’AraC, si son effet se cantonne à la phase de réplication du cycle cellulaire. Ceci laisse supposer que l’AraC pourrait créer des dommages cellulaires en phase G1, en instaurant un état de stress oxydatif par exemple, et que de la même manière qu’ATR joue un rôle important en phase G1 en réponse à un stress induit par des rayonnements ultra-violets, Chk1 pourrait être impliquée

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dans la réponse à l’AraC au cours de cette étape du cycle cellulaire (Gamper et al., 2013). Chk1 pourrait être aussi important en phase G1 pour la réplication translésionnelle ou la réparation des régions d’ADN non répliquées durant la phase S précédente du fait de l’état de stress réplicatif, et prises en charge par les protéines 53BP1 durant la mitose afin de limiter l’apparition de cassures double brins de l’ADN (Harrigan et al., 2011; Lukas et al., 2011). Nos résultats nous ont amené à la conclusion que Chk1 est une cible thérapeutique intéressante dans les LAM, et notamment chez les patients dont l’expression génique et protéique est la plus élevée. Nous pourrions éventuellement affiner encore l’impact pronostic de Chk1 dans les LAM en prennant en compte la localisation sub-cellulaire de Chk1, si on se réfère aux travaux de Al-kaabi et al dans le cancer du sein. En effet, par l’observation de la localisation de Chk1 phosphorylée sur le résidu s317 sur des coupes immunohistohimiques de cancer de sein, cette équipe a pu montrer que selon les échantillons, phospho-Chk1 présente une localisation nucléaire ou cytoplasmique. De plus, en l’absence de tout traitement, l’expression nucléaire de phospho-Chk1 au sein d’une tumeur corrèle avec la présence de paramètres de bon pronostic (faible activité mitotique, faible expression de KI67 et de PI3K, etc..). A contrario, l’expression cytoplasmique de phospho-Chk1 est associée à des caractéristiques de mauvais pronostic (tumeur de grade élevé, phénotype triple négatif, expression de KI67, Akt, PI3K, etc..).

Par ailleurs, l’expression nucléaire de phopho-Chk1 est prédictive d’une meilleure survie globale tous patients confondus, et chez les patients présentant des tumeurs positives pour les récepteurs aux oestrogènes, chez les patients ne recevant aucune chimiothérapie. Dans le