Mesure de la hauteur de l’ADN

III.5.1. Protocole

On rassemble dans cette partie toutes les mesures de hauteur que l’on a effectué sur l’ADN à l’AFM. On ne considère cependant que les cordes d’ADN les plus petites qui ne comporte que quelques molécules d’ADN. Pour une surface donnée, on prend toutes nos images sur cette surface indépendamment de la méthode de dépôt.

La question qui motive cette étude est d’une part de savoir si l’ADN est contraint sur la surface. D’autre part, un résultat récent [Kasumov 2002] met en évidence l’importance de la hauteur de l’ADN sur les propriétés de conduction de l’ADN.

Dans le cas de la surface terminée méthyle, nous avons rencontré des problèmes pour mesurer la hauteur de l’ADN. En effet, pour quelques images, on a obtenu une variation de phase importante sur l’ADN et une hauteur de l’ADN toujours supérieure à 3nm. Les mesures de hauteur de ces surfaces n’ont pas été prises en compte pour tracer l’histogramme des hauteurs de la surface méthyle. On discute dans l’annexe B de ce problème de hauteur.

Dans Le cas des surfaces terminées vinyle et fluor on n’a pas suffisamment de mesures pour obtenir des histogrammes. Les quelques hauteurs qu’on a mesurées dans ce cas sont de l’ordre de 1nm.

Les histogrammes de hauteur sont représentés pour chaque surface sur la figure III.24.

III.5.2. résultats

On peut constater que quasiment toutes nos mesures sont inférieures à 2nm (le diamètre cristallographique de la forme B de l’ADN).

Les histogrammes des surfaces polystyrène, pentacène, et SiH présentent deux pics distincts. Le deuxième pic est beaucoup plus élargi et situé à une hauteur double du premier. On a certainement des pics bien définis pour ces trois surfaces en partie parce qu’elles ont une bonne planéité, condition nécessaire pour bien distinguer des hauteurs de l’ordre du nm. Dans le cas de la surface SiH les deux pics sont beaucoup moins nets que pour le pentacène et le polystyrène. On a représenté l’intégrale de la répartition de taille obtenue à partir des données brutes pour cette surface. On distingue mieux sur l’intégrale les points d’accumulation en taille pour le premier et le deuxième pic.

Pour la surfaces SiO2 on peut distinguer un pic principal puis un deuxième beaucoup plus élargi.

Pour les autres surfaces : amine, PMMA, et méthyle, on ne distingue qu’un seul pic très élargi, avec une taille minimale de la hauteur de l’ADN.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 0 2 4 6 8 10 12 14 SiO₂ no mbr e de mesur e hauteur (nm) ^{0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5} 0 5 10 15 20 25 -NH₂ Nombre de m e sure hauteur (nm) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Méthyle nombre d e mesure hauteur (nm) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PMMA no mbr e d e mes u re hauteur (nm) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Polystyrène n ombr e de mes ur e hauteur (nm) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 No mb re d e m es u re hauteur (nm) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 0 2 4 6 8 10 pentacène nombre de mesure hauteur (nm)

Figure III.24 : Histogramme des hauteurs

de l’ADN. Les mesures sont faites en AFM en mode tapping. On indique par des flèches le premier et le deuxième pic de l’histogramme. Pour la surface SiH, on donne l’intégrale de la densité de hauteur pour bien distinguer l’accumulation de valeur autour de 0.6nm.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 10 20 30 40 50 SiH Inté gra le hauteur (nm)

III.5.3. Interprétation

Le fait qu’on puisse distinguer deux pics dont l’un correspond à une hauteur double du premier, peut être interprété comme la hauteur d’une molécule pour le premier pic et la hauteur de deux molécules pour le deuxième.

Si on mesure la hauteur d’une molécule cela ne signifie pas qu’on a une molécule dans la corde d’ADN. En effet deux molécules peuvent être côte à côte. Dans ce cas, on ne va mesurer que la hauteur d’un seul brin. La résolution latérale de l’AFM ne permet pas a priori de distinguer entre deux molécules l’une à coté de l’autre et une seule molécule.

De même on peut supposer que la hauteur double observée correspond aux molécules réparties sur deux niveaux. Là encore on ne peut pas a priori à l’AFM dire combien il y a de molécules côte à côte.

Dans le cas où deux molécules forme des plectonèmes, on peut s’attendre à un doublement de la hauteur.

Le fait que l’on ait très peu de valeurs de hauteurs entre les deux pics (pour les surfaces polystyrène, SiH et pentacène) est peut être la signature d’une structure ordonnée de l’ADN sur la surface.

L’ADN est certainement contraint sur la surface. Par conséquent on peut donner une autre explication des différentes hauteurs observées. En effet, il est possible que deux molécules d’ADN l’une à coté de l’autre se stabilise mutuellement [Mou 1995] [Keller 1989] et adopte une configuration où la hauteur de chaque molécule est plus importante.

Cette explication permettrait d’expliquer les histogrammes obtenus sur les autres surfaces. En effet, si l’ADN peut adopter différentes configurations on peut s’attendre à un élargissement des pics de l’histogramme.

Tous les histogrammes présentent une valeur minimale de la hauteur mesurée qui est inférieure de moitié environ au pic principal. Ces mesures doivent certainement correspondre à des molécules d’ADN fortement contraintes, ou bien a des mesures sur des zones plus rugueuses. Dans ce cas, la molécule suit la topographie de la surface et il est difficile de remonter à sa véritable hauteur.

On peut déduire de toutes ces mesures la hauteur moyenne d’une molécule d’ADN sur chaque surface :

SiO2 : ~0.5nm Amine : ~0.5nm Méthyle : ~1nm PMMA : ~0.6nm Polystyrène : ~0.9nm SiH : ~0.3nm Pentacène : ~0.5nm

Dans le cas de la surface terminée méthyle nous avons eu pour certaines images une surévaluation de la hauteur de l’ADN (cf. Annexe B). Le problème dans ce cas vient du contraste entre l’ADN qui est hydrophile et la surface qui est hydrophobe. Pour éviter ce problème nous avons métallisé l’échantillon avec une fine couche de platine. Dans ce cas, on mesure une hauteur d’environ 1nm pour les molécules. Cette valeur est cohérente avec les valeurs de hauteur de l’histogramme.

2002], l’ADN a une hauteur de 2.4nm. De plus, ce traitement rend la surface de mica relativement hydrophobe (θH2O~90°).

Il est étonnant que l’on mesure sur nos surfaces terminées amine une hauteur de 0.5nm pour une molécule d’ADN alors que la composition chimique de nos surfaces terminées amine ressemble à celles de Kasumov.

On notera enfin, que c’est sur nos surfaces hydrophobes que l’on mesure la hauteur la plus importante pour une molécule d’ADN (sauf pour SiH et le pentacène). Le caractère hydrophobe de la surface joue certainement un rôle pour obtenir un dépôt d’ADN avec la bonne hauteur (~2nm). Dans notre cas, on peut attribuer la faible hauteur mesurée sur nos surfaces hydrophobes au sur étirement excessif de la molécule qui doit s’accompagner d’une diminution du diamètre de la molécule.

Il serait intéressant de vérifier quelle hauteur aurait l’ADN sur une surface avec une monocouche mixte de deux silanes terminés amine et méthyle…

Dans le cas des surfaces SiH et pentacène qui sont relativement hydrophobes il est étonnant de trouver des hauteurs aussi faibles (0.3nm et 0.5nm respectivement). Dans ce cas, l’ADN interagit certainement de manière spécifique avec ces surfaces, par comparaison aux surfaces terminées méthyle ou polystyrène. Dans le cas de la surface SiH on peut également expliquer le déficit en hauteur par le fait qu’on a une réoxydation partielle qui diminue le caractère hydrophobe de la surface.

IV. Conclusion

Nous avons présenté dans ce chapitre nos résultats sur le traitement de nos surfaces et le dépôt d’ADN.

Pour la préparation des surfaces à contraste chimique, nous avons obtenu les meilleurs résultats avec une matrice méthyle et une silanisation amine dans les ouvertures. C’est certainement par l’utilisation d’une couche d’accroche en polystyrène qui protège la surface de la pollution apportée par la résine optique qui explique ce bon résultat. Nous avons préparé ces surfaces en vue de greffer chimiquement et sélectivement l’ADN sur certaines zones.

La technique de dépôt d’ADN avec une goutte que l’on laisse incuber sur la surface quelques minutes puis qu’on enlève est très simple à mettre en œuvre mais sur étire excessivement l’ADN. Il n’y a que sur la surface terminée amine que l’ADN a la longueur attendue de 16µm.

En revanche, lorsqu’on laisse sécher une goutte de solution contenant de l’ADN, on obtient des cordes d’ADN de toutes les tailles allant de quelques molécules à plusieurs milliers de brins jusqu’à des paquets d’ADN visibles à l’oeil nu. Ces échantillons nous ont permis d’étudier la conductivité de corde d’ADN en fonction de la taille (nombre de molécules dans la corde) du système.

Nous avons déduit de l’histogramme de hauteur de l’ADN sur nos différentes surfaces une hauteur par molécule d’ADN inférieure à 1nm. Les surfaces hydrophobes donnent la hauteur la plus importante à l’exception des surfaces SiH et pentacène.

des molécules d’ADN qui ne soit pas sur étirées. Dans ce cas, on peut s’attendre à trouver une hauteur plus importante que sur nos surfaces hydrophobes, où les molécules d’ADN sont complètement surétirées.

Chapitre IV

I. Introduction

Nous présentons dans ce chapitre nos mesures électriques sur des molécules d’ADN. Une bonne partie des mesures n’ont rien donnée (pas de courant). C’est particulièrement vrai pour l’ADN déposé sur des électrodes. Dans ce cas, nous n’avons jamais mesuré de courant.

En revanche l’utilisation du Conducting – AFM a donné des résultats. L’intérêt est de pouvoir facilement étudier la conduction en fonction de la distance à l’électrode. Nos résultats sont peu dépendants de la surface sur laquelle repose l’ADN.

Les mesures effectuées sur des échantillons où l’électrode en métal (or ou platine) est évaporée sur l’ADN n’ont pas données de signal en Conducting – AFM. L’ADN est certainement endommagé au cours de l’évaporation. Cela nous a poussé à utiliser un conducteur organique qui permet de contacter électriquement l’ADN dans des conditions plus douces. Mais là encore, les résultats se sont avérés décevants. Nous n’avons réussi qu’un petit nombre de mesures sur l’ensemble de la thèse avec des niveaux de courant d’environ 1nA (10

-9A) pour 1V sur des distances d’au moins 100nm. Toutes les autres mesures se sont soldées par l’absence totale de courant.

Afin d’améliorer le contact électrique, nous avons utilisé une interface qui consiste en un amas d’ADN sur lequel on dépose le métal de l’électrode. La mesure électrique en AFM conducteur se fait sur des cordes qui dépassent de cet amas. Dans ce cas, nous avons quasiment à chaque fois mesuré du courant à un niveau de l’ordre du pA (10-12A). Le défaut d’un tel système est sa complexité. Néanmoins nous avons pu mesurer des caractéristiques courant – tension, et d’étudier le courant qui passe dans la structure en fonction de la distance et surtout du nombre de brins d’ADN dans la corde (jusqu’à 10000 molécules).

Les mesures en EFM permettent de travailler dans des conditions mieux contrôlées puisqu’on n’a pas le problème du contact avec les électrodes. Nous comparons nos résultats avec des simulations afin d’estimer les propriétés diélectriques de l’ADN.

Nos mesures les plus récentes ont été effectuées sur des fibres d’ADN de quelques dizaines de microns de long. Les niveaux de courant sont assez importants (de l’ordre du nA 10-9A). Dans de telles structures la conduction est très sensible aux conditions d’humidité ambiante.