Acétone ; Alcool isopropylique ; toluène ; EDI ;…
Figure III.04 : Protocole pour la préparation des surfaces avec contraste chimique. On utilise une couche d’accroche en Polystyrène (PS) pour que la résine optique puisse tenir sur la surface méthyle. PS Plasma O2 30secondes 10mn Résine Silane greffé
greffage du deuxième silane. Afin d’enlever les premières molécules greffées dans les ouvertures définies par la résine optique, on utilise un plasma O2 (cf. figure III.04). Dans le cas du silane OTS (terminaison méthyle), on doit d’abord graver toute la couche de polystyrène avant d’attaquer la monocouche de molécules. Sachant que la gravure des résines et du polystyrène est de l’ordre de 200nm/mn, on a un temps typique de plasma de 10minutes. Le temps de gravure ne doit pas être trop long car le polystyrène sous l’effet des espèces réactives finit par durcir, et il n’est alors plus possible de l’enlever. De plus, la gravure sur la lame n’est pas homogène. Par conséquent il faut surestimer le temps de plasma pour être sure qu’il atteigne la couche organique.
Dans le cas où la résine optique a été déposée directement sur les molécules greffées sans couche d’accrochage en polystyrène (cas des silanes terminés amine et vinyle) le temps de gravure est beaucoup plus court de l’ordre de 1 minute puisqu’il n’y a que la couche de molécule à graver. En toute rigueur quelques secondes suffiraient largement, mais afin d’enlever des restes de résine au fond des ouvertures on surévalue le temps de gravure.
On a également fait le protocole avec une lame sans traitement. On fait juste du greffage dans des ouvertures. Nous avions utilisé cette technique avec de la résine électronique pour mesurer la hauteur de nos couches organique (cf. chapitre II). Dans ce cas on fait la même chose mais avec de la résine optique.
Une fois que la première couche organique a été gravée, il reste à effectuer la deuxième silanisation. Avant toute chose, il faut enlever les polymères (résine optique et éventuellement polystyrène) déposés sur la surface sans polluer les zones de la lame découverte et nettoyée par le plasma. Cela peut se faire mécaniquement. Un jet de gaz à haut débit peut être suffisant pour arracher le polystyrène qui ne tient pas très bien sur la surface terminée méthyle. Il ne faut pas insister trop longtemps avec cette méthode puisque le gaz n’est pas parfaitement pur et on finit par polluer la surface. On peut également utiliser différents solvants. On enlève le gros de la résine en projetant l’acétone sur la lame. Il y a un double intérêt à agir de la sorte. Premièrement, on limite les risques de redéposition. De plus, la vitesse du solvant agit mécaniquement pour enlever la résine. Une fois que toute la résine est enlevée (inspection visuelle) on peut effectuer un nettoyage par ultrason avec comme solvant de l’acétone, de l’alcool isopropylique, du toluène, ou de l’eau désionisée (EDI). On peut même faire un ultrason avec le bain de silanisation (toluène + silane). Dans ce cas, le toluène permet d’enlever la résine et de faire la silanisation en même temps. Cette dernière méthode est intéressante puisque on profite bien de la surface fraîchement préparée par le plasma.
II.3.2.2. Masque utilisé
Le masque que l’on a utilisé est représenté sur la figure III.05. On a des carrés de 100µm de coté. On a une densité variable de petite carrés à l’intérieur de ces carrés de 100µm. La résolution du scanner ne permet pas de distinguer les détails dans les ouvertures. On ne voit que des motifs de 100µm. On s’attend à avoir un niveau de fluorescence qui dépend du taux de couverture. En particulier on a 30% de couverture pour le deuxième et le troisième motif (cf. figure III.05) mais avec une répartition différente. Cela nous permet de vérifier l’influence de la géométrie des motifs sur le greffage. Le taux de couverture du dernier motif est 12%.
effet on n’a pas à chercher longtemps les plus petits motifs. De plus, on sait sans ambiguïté si on est bien sur une zone correspondant au masque. En effet le scanner de l’AFM a une amplitude de 15µm dans le plan xOy. On peut donc observer le motif en entier. On ne mesure pas d’artefact.
-NH2
Hauteur 2.0nm
Figure III.06 : Etat de la surface après une ouverture dans la première molécule. Dans ce cas l’ouverture a été faite dans une couche silanisée amine. On trouve le double de la hauteur attendue.
SiO2
Figure III.05 : Le masque optique utilisé pour les tests de mise au point de la méthode de greffage avec contraste chimique. On a quatre motifs répétés quatre fois. Ce sont des carrés de 100µm de coté composés de carrés de plus petite taille. La couverture dans chaque carré par rapport au plus grand est de 30%, 30% et 12%..
100µm
-NH2 –CF3
La zone silanisée amine ne donne pas toujours du signal en fluorescence
-NH2 SiO2
? Pas cohérent
Celui qui marche le mieux -CH3 -NH2
La zone silanisée amine ne donne pas toujours du signal en fluorescence -NH2 –CH=CH2
La zone silanisée amine ne donne pas de signal en fluorescence SiO2 -NH2
La zone silanisée amine ne donne pas de signal en fluorescence –CH=CH2 -NH2
Figure III.07 : Résultats représentatifs de tous les essais de greffage avec contraste chimique. La combinaison la plus reproductible est la silanisation méthyle puis amine dans les ouvertures. Pour toutes les autres combinaisons soit le silane amine ne s’est pas greffés, soit on a carrément l’inverse de la combinaison attendu (image barrée d’une croix). Les images encadrées en pointillé correspondent à ce qu’on attendait. L’échelle des couleurs est la même que celle de la figure III.03.
-NH2 -CH3 Matrice Ouverture
L’ensemble des résultats est résumé sur la figure III.07. La combinaison la plus reproductible est la silanisation pleine plaque du silane terminé méthyle, puis le greffage de l’amine dans les ouvertures.
Le désaccord principal que l’on observe sur certaines lames est que les zones silanisées amine ne donnent aucun signal en fluorescence, ou bien le signal n’est pas homogène sur la surface. En revanche les autres molécules donnent le signal attendu (correspondant au niveau de fluorescence du silane pleine plaque cf. II.3.1.). Il y a une exception pour le silane terminé méthyle qui a donné pour une lame un signal important alors qu’on attendait un niveau de fluorescence faible (i.e. une couleur sombre). Ces désaccords peuvent avoir comme origine la pollution de la surface. Elle provient en partie de la résine optique utilisée bien que ce ne soit pas la seule cause. Plusieurs observations vont dans ce sens. En effet, la solution contenant la rhodamine COCHO de l’IBL a cessé d’être active lorsqu’on y a trempé des lames sur lesquelles il restait de la résine optique. De plus, les lames traitées dans les bains de silanisation qui contenait d’autres lames avec de la résine optique n’ont pas donné de signal, suggérant un mauvais greffage de l’amine ou la consommation de la fonction amine par la résine optique. Par conséquent, avant chaque étape chimique, il faut
prendre soin d’enlever toute trace de résine. Il est néanmoins difficile avec le peu
d’expériences effectuées d’affirmer quelle est l’origine exact des désaccords dans les niveaux de fluorescence observés.
100µm
Figure III.08 : Contraste chimique obtenu sur une lame de microscope. La matrice est un silane OTS (terminaison méthyle). On a greffé un silane amine dans les ouvertures. Le niveau de fluorescence de chaque zone est en accord avec le niveau que l’on peut attendre pour un greffage pleine plaque. On
On donne sur la figure III.08 le résultat obtenu avec une matrice de silane OTS (terminaison méthyle) avec un silane terminé amine dans les ouvertures. On peut noter l’homogénéité du résultat. On trouve à peu près pour chaque zone le niveau de fluorescence mesurée dans le cas où la silanisation est pleine plaque. Le fait que cette combinaison marche le mieux provient certainement du fait qu’on a utilisé une couche d’accroche en polystyrène qui protège la surface de la pollution dû à la résine optique.
La figure III.06 représente l’état de la surface après l’étape de gravure du premier silane et après avoir enlevé la résine. On peut constater qu’il y a des débris sur la surface. La zone gravée est très bien définie. On passe en quelques nm du silane terminé amine à la surface de SiO2. La hauteur du film moléculaire est de 2nm. Cela correspond à deux fois la hauteur de la molécule utilisée. Ce n’est pas étonnant de trouver une hauteur plus importante pour le silane terminé amine puisqu’il a tendance à polymériser sur la surface [cf . chapitre II] [Martel 2000].
On notera qu’on a moins de problèmes de pollution avec les résines électroniques : PMMA et Copolymère. En effet les tests de greffage de différents silanes donne une hauteur de la molécule en accord avec la hauteur attendue. Tous ces résultats sont donnés au chapitre II. En revanche, l’inconvénient de l’utilisation de ces résines est le temps d’écriture au masqueur électronique (plusieurs heures d’écriture avec la nécessité de travailler sous vide). C’est pour cette raison que nous avons choisi les résines optiques.
II.3.2.4. Conclusion
Parmi toutes les combinaisons essayées, c’est la combinaison avec une matrice de silane OTS (terminé méthyle) et le silane terminé amine dans les ouvertures qui a donné les meilleurs résultats. On interprète ce résultat par le fait que le polystyrène que l’on a employé comme couche d’accroche de la résine optique protège en fait la surface de la pollution du à la résine optique.
Par conséquent la stratégie pour obtenir des contrastes chimiques est d’utiliser une couche de polymère (le polystyrène par exemple) avant de déposer la résine optique. Les résines électroniques sont moins problématiques du point de vue de la pollution apportée, mais dans ce cas, le temps d’écriture au masqueur électronique est rédhibitoire (cf. chapitre II).
On peut envisager d’autres moyens de graver la première couche organique. Par exemple avec un masque mécanique. Dans ce cas, on limite les problèmes de pollution ainsi que les étapes technologiques.
Faute de temps, nous n’avons pas utilisé cette stratégie pour déposer l’ADN sur nos surfaces. Le travail qui restait à faire (principalement à l’IBL) était la préparation de l’oligonucléotide complémentaire des 12 paires de base pendantes du λ-ADN, muni d’une fonction α-oxo aldéhyde. L’hybridation et la ligation de l’oligo sur l’ADN permet alors le greffage de l’ADN sur les zones initialement terminées amine.
Ce travail a été repris par Vincent Haguet pour la réalisation de puces à détection électrique de processus biologique [Haguet 2002].