A avaliação dos diferentes métodos de extração para a identificação dos compostos fenólicos em cevada foi realizada por meio da caracterização dos extratos pela técnica de infusão direta no espectrômetro de massas, a qual teve como objetivo a visualização dos perfis espectrométricos de composição de cada extrato, buscando identificar possíveis flavonóides e ácidos fenólicos desprotonados presentes nos mesmos, através das razões m/z [M-H]-, onde M representa a massa da molécula avaliada. Mesmo na ausência da separação cromatográfica (como na LC-MS/MS), esta análise permite a confirmação dos compostos fenólicos baseada no perfil da fragmentação obtido para as moléculas a partir de seus padrões comerciais. Inicialmente foram avaliados os modos de ionização positivo (ESI(+)- MS/MS) e negativo (ESI(-)-MS/MS) utilizando a solução dos padrões dos compostos fenólicos por meio da infusão direta. A ionização dos compostos fenólicos, em modo negativo, apresentou melhor detectabilidade e, portanto, os espectros de massas foram obtidos neste modo, produzindo uma molécula desprotonada [M-H]- [121]. Os espectros de massasdos padrões de compostos fenólicos no modo negativo pode ser visto nas Figuras de 10-16.
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Figura 10: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z193 (ácido ferúlico) no padrão.
Figura 11: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p-cumárico) no padrão.
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Figura 12: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289(catequina) no padrão.
Figura 13: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (epicatequina) no padrão.
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Figura 14: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 179 (ácido cafeico) no padrão.
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Figura 16: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z167 (ácido vanílico) no padrão.
O perfil dos espectros de massas dos padrões foram comparados com os espectros dos extratos, visando a identificação dos analitos presentes na cevada. A identificação dos compostos fenólicos foi realizada no modo de monitoramento seletivo de reações (SRM), que é um tipo de varredura que relaciona a fragmentação de um íon precursor no triplo quadrupolo por MS1 aos seus correspondentes íons produtos que passam por MS2.
Os extratos foram obtidos por diferentes métodos de extração a fim de isolar os compostos fenólicos e, posteriormente, identificá-los. Diferentes procedimentos foram avaliados para verificar quais condições seriam mais adequadas para extrair os compostos fenólicos da cevada.
Um dos procedimentos avaliados foi a hidrólise ácida que envolve o tratamento do extrato ou da matriz vegetal com soluções aquosas ou alcoólicas contendo ácido, como HCl, submetidas à temperatura de 80°C, ou superior a esta [28]. Para extração de compostos fenólicos em grãos, pode-se optar pelo procedimento de hidrólise ácida ou hidrólise básica que é voltado para extração de compostos fenólicos insolúveis (CFI). Os compostos fenólicos raramente estão
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presentes nos vegetais em sua forma livre, mas comumente, apresentam-se em sua forma glicosilada [46].
O método A utilizou hidrólise ácida no extrato de acetonitrila com adição de ácido clorídrico 37% (v/v) e aquecimento a 80°C. A hidrólise ácida tem o objetivo de quebrar a ligação entre o composto fenólico e a parte glicosídica transformando todos os compostos fenólicos nas formas agliconas. Por outro lado, a hidrólise básica pode quebrar as ligações do éster, removendo grupos ácidos que estão ligados à parte glicosídica dos compostos fenólicos.
Em seguida o pH do extrato foi ajustado com NH4OH para que os
compostos fenólicos ficassem na forma desprotonada, favorável para análise dos mesmos no modo negativo por meio da infusão direta. A Figura 18 mostra a fragmentação obtida para o extrato A, indicando os fragmentos do ácido ferúlico.
Figura 17: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato A.
A molécula de ácido ferúlico (m/z 193) eliminou o dióxido de carbono (m/z 44) para formar íons de m/z 149. O fragmento m/z 178 corresponde à perda de um grupo metila. Um dos picos mais abundante deste ácido (m/z 134) foi formado por eliminação de dióxido de carbono (CO2) e um grupo metila.
Também foi avaliada a hidrólise básica no método B, consistindo no tratamento dos resíduos da extração com solução de NaOH 2 mol L-1.
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No entanto, não foram identificados compostos fenólicos nos resíduos sólidos obtidos após extração com os métodos B1, B2 e B3. Provavelmente, os compostos fenólicos foram extraídos antes da hidrólise, indicando que neste caso, a extração com etanol, água ou a mistura etanólica são eficientes para a extração dos compostos fenólicos. Outra possibilidade é que as condições de hidrólise empregadas foram brandas.
Compostos fenólicos com alta polaridade, como alguns ácidos fenólicos (ácido cafeico, ferúlico e clorogênico), podem não ser adequadamente extraídos com solventes orgânicos puros, sendo que, normalmente, as soluções extratoras consistem de solventes em diferentes frações aquosas [28, 122]. O solvente extrator empregado no método C, etanol, já foi testado e avaliado como um dos mais eficientes para a extração de compostos fenólicos em cevada [39, 42], sendo, portanto, empregado neste trabalho, a mistura hidroetanólica 80%(v/v). Neste procedimento foi avaliada a influência da atmosfera inerte durante o aquecimento, uma vez que os compostos fenólicos podem ser degradados quando expostos ao oxigênio do ambiente. Além da extração sob agitação, foi avaliada a extração contínua pelo sistema de refluxo. Este tipo de extração foi testada por ser um método eficiente e bem estabelecido na literatura para extração de compostos fenólicos [117, 123]. Vale ressaltar que tanto nos métodos B quanto nos métodos C foi adicionado hexano nos extratos, sob agitação magnética, para a remoção da gordura para posterior etapa de extração com adição da mistura hidroetanólica. Esta etapa de clean-up foi usada para minimizar os interferentes na análise cromatográfica.
Para a identificação dos compostos fenólicos nos extratos, foram avaliados os espectros de massas dos íons produto. Nos métodos C1 e C2 que empregaram agitação magnética em chapa de aquecimento, foram identificados o ácido ferúlico, ácido p-cumárico, catequina e epicatequina (Figuras 18- 24).
A molécula de ácido ferúlico (m/z 193) nos extratos C2 também eliminou o dióxido de carbono (m/z 44) para formar íons de m/z 149. O fragmento m/z 178 corresponde à perda de um grupo metila. O pico mais abundante deste ácido (m/z 134) foi formado por eliminação de dióxido de carbono (CO2) e um grupo metila.
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Figura 18: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato C1.
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Figura 19: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato C2.
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O ácido p-cumárico se ioniza no modo negativo gerando os principais fragmentos de m/z 119 e m/z 93 (Figura 20 e 21).
Figura 20: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p cumárico) no extrato C1.
Figura 21: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p cumárico) no extrato C2 .
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Já a catequina produziu a molécula desprotonada [M-H]- (m/z 289) e
perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245), de acordo com Perez-Magarino et al.
[124].
Figura 22: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (catequina) no extrato C1.
Figura 23: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (catequina) no extrato C2.
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A catequina e epicatequina são considerados isômeros, portanto possuem a mesma massa molar. O que difere uma molécula de outra é o desvio da luz polarizada na posição da hidroxila no sentido S, levógero (anti-horário) e no sentido R, destrógiro (horário). Portanto, estes isômeros apresentam os mesmos fragmentos.
A epicatequina também produziu a molécula desprotonada [M-H]- (m/z
289) e a perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245) [124].
Figura 24: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (epicatequina) no extrato C2.
Pelo método C3, o qual diferiu dos métodos C1 e C2 devido a utilização de uma manta de aquecimento sob atmosfera inerte (gás nitrogênio), foram identificados os mesmos compostos: ácido ferúlico, ácido p-cumárico, catequina e epicatequina, e mais o ácido cafeico. Já no método C4 que utilizou sistema de refluxo, foram identificados os ácidos cafeico, ácido p-cumárico, catequina, epicatequina, além da rutina e ácido vanílico (Figuras 25-35).
Nas Figuras 25 a 35 são apresentados os espectros de identificação dos extratos C3 e C4.
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Figura 25: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 193 (ácido ferúlico) no extrato C3.
O espectro de massas do ácido cafeico (Figuras 26 e 27) desprotonado (m/z 179) produziu um pico com m/z 135, devido à perda de CO2, mas sem outros
fragmentos abundantes.
Nas Figuras 28 e 29, a catequina produziu a molécula desprotonada [M- H]- (m/z 289) e perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245), de acordo com Perez-
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Figura 26: Espectro de massasde ESI(-)-MS/MS do íon m/z 179 (ácido cafeico) no extrato C3.
Figura 27: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 179 (ácido cafeico) no do extrato C4.
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Figura 28: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (catequina) no extrato C3.
Figura 29: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (catequina) no extrato C4.
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Figura 30: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (epicatequina) no extrato C3.
Figura 31: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 289 (epicatequina) no extrato C4.
A epicatequina também produziu a molécula desprotonada [M-H]- (m/z 289) e a perda de um grupo –CH2CHOH- (m/z 245) (Figuras 30 e 31). O ácido p-
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cumárico se ioniza no modo negativo gerando o principal fragmento de m/z 119. Os espectros para os métodos C3 e C4 podem ser vistos nas Figuras 32 e 33.
Figura 32: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p-cumárico) no extrato C3.
Figura 33: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 163 (ácido p-cumárico) no extrato C4.
Para flavonóis O-glicosilados, tais como rutina, o espectro gerado mostrou a molécula desprotonada [M-H-] do glicosídeo e o íon correspondente à aglicona desprotonada (a-H)-. Assim, para a rutina (Figura 34) foi observada a perda da unidade de ramnose-glucose (m/z 301) [125].
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Figura 34: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 609 (rutina) no extrato C4.
Figura 35: Espectro de massas de ESI(-)-MS/MS do íon m/z 167 (ácido vanílico) no extrato C4.
Para o ácido vanílico são gerados os principais fragmentos m/z 152>m/z 108 conforme a Figura 35.
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Na Tabela 3 são apresentados os compostos fenólicos identificados nos diferentes extratos.
Tabela 3: Presença de compostos fenólicos em diferentes extratos.
A partir da quantidade de compostos fenólicos identificados nos extratos, selecionaram-se os métodos C3 e C4 para otimização dos parâmetros de extração uma vez que estes métodos indicaram um maior número de compostos identificados.