Le MDEB qui contient un BOC mais pas de phényls (voir figure 17, chapitre Matériel et
Méthodes) potentialise fortement le SOCE mais à des concentrations beaucoup plus
élevées que le 2-APB. Malgré son manque d’affinité, le MDEB est une molécule très intéressante car elle potentialise le SOCE sans l'inhiber même à de très fortes doses.
XXXI. EFFETS DES ANALOGUES DU 2-APB SUR LES INSP
3RS
Sachant que le 2-APB est un inhibiteur des InsP3Rs, nous avons étudié les effets de ses analogues sur ces récepteurs. A l’exception du MDEB, tout les analogues étudiés ont inhibé la libération du Ca2+ à partir du RE en inhibant les InsP3Rs.
Le Methoxy-APB, le Dimethoxy-APB, le Cyclic-APB, le Thienyl-APB et le Benzothienyl-APB ne sont pas spécifique du SOCE car ces molécules inhibent en plus les InsP3Rs. En revanche, le MDEB n'affecte pas la libération du Ca2+ à partir du RE par les InsP3Rs, et il est plus spécifique du SOCE.
XXXII. MDEB POTENTIALISE LE I
CRACLe SOCE est le mécanisme d’influx majeur chez les lymphocytes caractérisé par ICRAC. Nous voulions confirmer l’effet du MDEB sur l’augmentation de la [Ca2+]cyt en patch- clamp en mesurant en configuration cellule-entière le ICRAC. Nous avons pu mettre en évidence une potentialisation par le MDEB de l’amplitude du ICRAC dans les cellules Jurkat dont le SOCE a été induit par deux chélateurs de Ca2+, l’EGTA et le BAPTA.
Plusieurs études ont montré que le Ca2+ intracellulaire inhibe le ICRAC en deux manières différentes. Une phase lente qui se produit dans des dizaines de secondes, un processus qui se produit en partie suite au remplissage des réserves en Ca2+ (Zweifach et Lewis, 1995a, Hoth et Penner, 1993, Zweifach et Lewis, 1995b). Et une
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS DISCUSSION
137 phase rapide d’inactivation due au Ca2+ qui inactive ICRAC en quelques millisecondes suivant l’application des voltages hyperpolarisant (Hoth et Penner, 1992, Hoth et Penner, 1993). Il a été montré que le 2-APB à faibles concentrations accélère l’inactivation rapide due au Ca2+ en parallèle à une augmentation de l’amplitude du
ICRAC. Le 2-APB à fortes concentrations (40µM) induit une augmentation transitoire de l’amplitude de ICRAC puis une inhibition complète. Cette inhibition de ICRAC est également associée à une suppression de l’inactivation rapide (Prakriya et Lewis, 2001).
Dans notre étude et en calculant les constantes d'inactivation rapide, nous avons montré qu’à la différence du 2-APB, le MDEB à 1 mM diminue l’inactivation rapide tout en gardant la potentialisation de ICRAC.
XXXIII. ANALOGUES DU 2-APB ET SYNTHESE DE L'IL-2
Les effets des analogues du 2-APB sur un des marqueurs de la prolifération lymphocytaire T qui est la synthèse de l’IL-2 stimulée par la PHA, montrent un effet inhibiteur de tous ces analogues.
Le Cyclic-APB et le Benzothienyl-APB ont été utilisés à des concentrations de 10 µM qui inhibent à la fois du SOCE et des InsP3Rs. L’inhibition de la synthèse de l’IL-2 observée avec le traitement des cellules avec les inhibiteurs du SOCE (le Cyclic-APB, le Benzothienyl-APB) est justifiée vue que le processus de la production de cytokine est Ca2+-dépendant et qu’il a été montré également que des antagonistes des InsP3Rs inhibe fortement la production de l’IL-2 (Dadsetan et al., 2008).
En revanche, l'effet le plus surprenant était celui du MDEB avec lequel on s’attendait à une augmentation de la production de l’IL-2 car c’est un potentialisateur du SOCE. Ce composé inhibait également la synthèse de l’IL-2 dans les cellules Jurkat stimulées avec la PHA.
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS DISCUSSION
138 Nous nous sommes posés la question si cette effet inhibiteur sur la synthèse de l’IL-2 n’est pas dû à une toxicité cellulaire par une surcharge en Ca2+. Les expériences de l'apoptose ont montré que le MDEB induit une mort des cellules Jurkat lorsqu’elles sont stimulées avec la PHA. Compte tenu de ces résultats, l’effet inhibiteur du MDEB sur la synthèse de l’IL-2 est probablement dû à une apoptose des cellules Jurkat suite à une surcharge calcique.
XXXIV. INFLUX SOCE DES PLB-985
La première étape de caractérisation de l’effet des analogues du 2-APB dans les cellules Jurkat nous a permis d’isoler deux molécules potentiellement intéressantes, le Benzothienyl-APB et le MDEB. La première molécule car elle est uniquement inhibitrice du SOCE avec une IC50 intéressante de 0,4 µM et la deuxième molécule car c’est le seul produit uniquement potentialisant du SOCE qui existe sur le marché.
L'activation physiologique du SOCE lors d'une stimulation des FPR par le fMLF (Montero et al., 1991) a été également étudiée. Dans notre modèle de cellules PLB- 985, contrairement au SOCE induit par la TG, l’augmentation de la [Ca2+]cyt est faible après une stimulation au fMLF en comparaison avec les cellules de la lignée HL-60 différenciées (Zou et al., 2012). En revanche, cette augmentation de la [Ca2+]cyt est similaire en intensité à celle enregistrée avec les neutrophiles humains (Salmon et Ahluwalia, 2010b).
Nous nous sommes intéressé à comprendre le faible influx apparent du Ca2+ suite à une stimulation avec le fMLF par rapport à une stimulation avec le WKYMVm ou une déplétion du RE avec la TG. Pour cela, nous nous sommes focalisés sur la composante influx en étudiant l'influx du Ba2+ et du Mn2+ qui ne sont pas extrudés de la cellule. Après une stimulation au fMLF, l’influx du Ba2+ était similaire à celui obtenu après stimulation avec le WKYMVm et la TG. De même, suite à une
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS DISCUSSION
139 stimulation des cellules par le fMLF, nous avons constaté un influx du Mn2+ important.
Ces résultats confirment une entrée des cations divalents suite à une stimulation au fMLF similaire à celle stimulée par le WKYMVm ou la TG. Ce qui suppose un effet similaire sur influx du Ca2+ stimulé par le fMLF mais qui est opposé par un fort efflux.
Quelques études ont montré que le fMLF exerce en partie un effet inhibiteur transitoire de l'influx de Ca2+ qui est supposé due à une activation de la protéine kinase C (PKC), un des régulateurs du SOCE (Montero et al., 1993b, Montero et al., 1993a, Lee et al., 1997) ou par un effet activateur de la PKC sur les PMCAs (Smallwood et al., 1988). L’activation des PMCAs augmente l’efflux du Ca2+ et peut expliquer la faible augmentation de la [Ca2+]cyt apparente que nous avons observé qui n’est en réalité que le résultat entre un influx de Ca2+ et un efflux important qui s’y oppose.
Peut être il serait intéressant d'étudier l'influx du Ca2+ suite à une stimulation avec le fMLF en inhibant l’efflux du Ca2+ par des inhibiteurs sélectifs des pompes PMCAs comme la carboxyeosine ou la famille des caloxines.