Plusieurs médicaments à base d’inhibiteurs de canaux calciques sont utilisés en thérapeutique cardiovasculaire. En revanche, jusqu’à maintenant aucune molécule ciblant le SOCE n’a été utilisée en thérapeutique malgré les grands progrès enregistrés afin de comprendre le mécanisme du SOCE surtout à la suite de la découverte des composants clés Orai et STIM (Sweeney et al., 2009).
Malgré la multitude d'outils pharmacologiques disponibles actuellement pour étudier le SOCE, le plus grand inconvénient est leur non spécificité. Parmi ces molécules nous pouvons citer : les imidazolés (exemple l’éconazole), les esters de Bore (2-APB), et les lanthanides (La3+, Gd3+). Ces produits en plus de leur action inhibitrice sur le SOCE, ils inhibent également aux mêmes concentrations d’autres types de canaux comme les canaux Cl- (Franzius et al., 1994).
1.
L
ES CATIONS TRIVALENTSL’influx SOCE a la particularité d’être inhibé par les cations trivalents comme le lanthane (La3+) et le Gadolinium (Gd3+). Le La3+ a été caractérisé comme le plus puissant inhibiteur du ICRAC dans des mastocytes de rat (Hoth et Penner, 1993).
Le Gadolinium (Gd3+) est un des inhibiteurs du ICRAC les plus utilisés. Son action a été mise en évidence pour la première fois dans les thymocytes de souris (Ross et
43 Cahalan, 1995). Il a été également utilisé comme un outil de distinction entre le SOCE endogène des cellules et le SOCE induit par les TRPC transfectées dans les cellules. Ces dernières sont insensibles à son effet inhibiteur du SOCE (Trebak et al., 2002). Ces cations trivalents inhibent le SOCE à des concentrations de l’ordre de micromolaire (µM).
2.
ML-9
Parmi les molécules inhibitrices du SOCE, ML-9 (1-(5-chloronaphthalene-1- sulfonyl)homopiperazine, HCl) (figure 9), qui a été initialement rapporté comme un inhibiteur de la MLCK (Myosin Light Chain Kinase) (Saitoh et al., 1987). Il a été montré que ML-9 inhibe le SOCE induit par la TG dans plusieurs cellules (Watanabe et al., 1998, Norwood et al., 2000, Smyth et al., 2008, Dehaven et al., 2009). Dans les neutrophiles humains, il a été montré que le ML-9 inhibe l’influx calcique induit par la TG mais non celui induit par la stimulation par le fMLF (Salmon et Ahluwalia, 2010a). Bien que le mécanisme d’inhibition de ML-9 sur le SOCE n’est pas bien connu, il existe une évidence d’une interaction directe de ML-9 avec STIM1 ce qui empêche son réarrangement au niveau des puncta (Smyth et al., 2008).
Figure 9. Structure du ML-9. Dessinée par le logiciel
44
3. D
ERIVES DE PYRAZOLEUn dérivé de pyrazole désigné BTP2 (3,5-bistrifluoromethyl pyrazol) (figure 10) a été caractérisé au départ comme un puissant inhibiteur de l’activation du NFAT (Nuclear
of activated T cell) et de la production de cytokines (Trevillyan et al., 2001). Ensuite, il
a été montré comme un puissant inhibiteur du SOCE et du ICRAC dans les lymphocytes T (Ishikawa et al., 2003, Zitt et al., 2004). Dans les neutrophiles, le BTP2 inhibe l’influx SOCE induit par TG et par le fMLF et réduit de 82% la production de FRO sans affecter la phagocytose ou la production de radicaux libres oxygénés intraphagosomaux (Steinckwich et al., 2007).
Le BTP2 n’est pas spécifique du SOCE car il active également les TRPM4 et courant calcique correspondant. En plus d’une inhibition du ICRAC, le BTP2 à 10 µM augmente 100 fois l’amplitude du courant calcique dû aux TRPM4 (Takezawa et al., 2006).
4. D
ERIVES IMIDAZOLESUn des premiers inhibiteurs de CRAC qui est largement utilisé est un composé antifongique le SKF-96365 (figure 11). Il bloque le SOCE dans différents types cellulaires (Parekh, 2010). Un autre dérivé imidazolé inhibiteur du SOCE l'éconazole est utilisé pour la caractérisation de ICRAC (Franzius et al., 1994).
45
5.
LE2-
AMINOETHOXYDIPHENYL BORATEa) STRUCTURE ET ACTIVITE
Le 2-aminoethoxydiphényl borate ou le 2-aminoethyl diphénylborinate (2-APB) (figure 12), un composé perméable a été décrit initialement comme un inhibiteur de l’activité du récepteur à l’InsP3 dans les microsomes cérébraux de rat.
Il inhibe de manière dose-dépendante l’ouverture du canal sans affecter la liaison de l’InsP3 à son récepteur (Maruyama et al., 1997). En même temps il a été rapporté que le 2-APB inhibe partiellement l’activité Ca2+-ATPase des pompes SERCA (Maruyama et al., 1997). Une étude dans les cellules musculaires lisses A7r5 montre que le 2-APB
Figure 12. Structure du 2-APB Figure 11. Structure du SKF-96365.
46 n’est pas spécifique des InsP3R car il inhibe les pompes Ca2+-ATPases et augmente la fuite non spécifique du Ca2+ des réserves (leak) (Missiaen et al., 2001). Chez la drosophile, le traitement des cellules mutées dans le gène trp, l’équivalent du gène TRP chez les mammifères, avec de fortes concentrations du 2-APB (500 µM) inhibe les réponses des cellules de la rétine (Ma et al., 2001) sachant que l’activation des canaux TRP est normale lors de stimulation par la lumière des Drosophiles en absence de InsP3R (Faurschou et Borregaard, 2003). En revanche, dans des hépatocytes de rat, le 2-APB inhibait l’influx SOCE induit par la TG sans avoir un effet sur les récepteurs à InsP3. L’effet direct sur ICRAC a été montré également en patch-clamp sur une lignée d’hépatome de rat H4-IIE (Gregory et al., 2001).
Il a été montré que la présence des récepteurs à l’InsP3 n'est pas nécessaire pour l’activation du SOCE (Ma et al., 2001,Gregory et al., 2001). Egalement dans des lignées DT40 où les gènes codants pour les trois types de récepteurs à l'InsP3 ont été invalidés (DT40KO pour InsP3Rs), le ICRAC induit par TG avait les mêmes propriétés et il est comparable à celui obtenu dans les cellules DT40 normales (Prakriya et Lewis, 2001, Broad et al., 2001).
Il a été rapporté que le 2-APB peut exister sous différentes formes : sous forme d’un monomère, une forme monomère mais avec un cycle qui se forme par liaison de l’atome d’azote (N) avec le Bore (B) formant un 3ème cycle par une coordination interne. Une forme pentacyclique avec la formation d’un dimère de deux 2-APB liés par des coordinations externes (figure 13) (Dobrydneva et Blackmore, 2001).
47 Figure 13. Les différentes formes de 2-APB
b) INTERET DU 2-APB
A faibles concentrations (1-5 µM) le 2-APB potentialise ICRAC dans les cellules Jurkat des lymphocytes T. En revanche, l’inhibition de ICRAC est observée à de fortes concentrations. A faibles concentrations le 2-APB accélère la phase d’inactivation rapide du ICRAC due au Ca2+ probablement par augmentation de la concentration du Ca2+ local (Prakriya et Lewis, 2001).
48 L’intérêt du 2-APB est sa capacité de potentialiser à faibles concentrations et d’inhiber à fortes concentrations le SOCE (figure 14), cette double activité fait du 2- APB l’outil de caractérisation le plus largement utilisé. Néanmoins, en plus de son action sur le SOCE, le 2-APB inhibe également les InsP3R avec une constante d’inhibition IC50 de 42 µM (Maruyama et al., 1997), SERCA (Missiaen et al., 2001), TRPC3 (Trebak et al., 2002).
Le 2-APB active également TRPV1, TRPV2 et TRPV3 avec des concentrations efficaces EC50 de 114 ± 8 µM, 129 ± 13 µM et 34 ± 12 µM respectivement(Hu et al., 2004) et il a une double activité sur TRPM7 avec une potentialisation à des concentrations de l’ordre des (100 µM) et une inhibition à partir de 1 mM (Li et al., 2006).
Afin d’améliorer la spécificité et l'efficacité de la molécule du 2-APB, plusieurs équipes se sont intéressées à la recherche de nouvelles molécules analogues du 2- APB. Lors d’un criblage de 600 molécules analogues du 2-APB, deux puissants inhibiteurs du SOCE : DPB162-AE et DPB163-AE ont été caractérisés (figure 15) (Zhou et al., 2007). Ces deux composés inhibent le SOCE des cellules Jurkat avec des Figure 14. Effet biphasique du 2-APB sur ICRAC. A) Dans les cellules HEK293, le 2-APB 3 µM ou
10 µM potentialisent le SOCE tandis que 30 ou 50 µM l'inhibent. B) Dans les cellules HEK293 surexprimant Orai1 et STIM1, l’amplitude du ICRAC est augmentée par le 2-APB 20 µM alors
49 IC50 de 0,32 µM et 0,43 µM pour DPB162-AE et DPB163-AE respectivement (Suzuki
et al., 2010). Leurs effets inhibiteurs ont été ensuite confirmés sur ICRAC des cellules
HEK293 co-exprimant Orai1 et STIM1 ; le DPB162-AE et DPB163-AE inhibent ICRAC avec des IC50 de 86 ± 21 nM et 170 ± 68 nM respectivement (Goto et al., 2010).
IV.
OBJECTIFS DE LA THESE
L’objectif principal de la thèse est la caractérisation des voies d’entrée du Ca2+ dans les PMN et ensuite établir leurs rôles dans les principales activités des neutrophiles comme la phagocytose, la production de FRO, le chimiotactisme et la dégranulation.
50 Nous avons utilisé comme modèle d’étude des cellules PLB-985 différenciées en cellules proches de neutrophiles.