Le 2-APB a été initialement caractérisé comme un inhibiteur des InsP3Rs (Maruyama et al., 1997). Pour évaluer l’effet que peuvent avoir ces analogues du 2-APB sur les InsP3Rs et par conséquent la libération du calcium à partir du RE vers le cytosol, les cellules Jurkat ont été stimulées en absence du Ca2+ extracellulaire avec la phytohémagglutinine (PHA) à 10 µg/ml, un ligand du TCR qui permet l’activation de la PLC, la production de l'InsP3 et par conséquent la libération du calcium dans le cytosol (Tsien et al., 1982, Imboden et Stobo, 1985). Les cellules ont été au préalable incubées pendant 5 min avec l’analogue de 2-APB et ensuite stimulées avec la PHA 10 µg/ml (figure 18).
Pour étudier la libération du calcium à partir du RE des cellules PLB-985 différenciées, la stimulation des cellules a été faite par le fMLF et WKYMVm qui se lient aux FPR et activent une cascade de signalisation conduisant à la production de
Figure 18. Protocole de mesure de la libération de Ca2+ à partir du RE. Les cellules Jurkat ou les cellules PLB-985 ont été pré-incubées avec les analogues du 2-APB pendant 5 minutes puis traitées avec la PHA 10 µg/ml en absence du Ca2+ extracellulaire.
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS
MATERIEL ET METHODES
61 l’InsP3 (Le et al., 2000). La TG a également été utilisée pour induire la libération du Ca2+ à partir du RE.
VII.
MESURE DE L’INFLUX DU BARYUM
Comme le Ca2+, le Baryum (Ba2+) est un cation divalent qui suit la même voie d’entrée que le Ca2+. En revanche, il est très faiblement extrudé par les pompes Ca2+- ATPase membranaires PMCA ou l’échangeur Na+-Ca2+ (Na+-Ca2+ exchanger, NCX). Ceci nous permettra de mesurer uniquement la voie d’entrée (influx). Afin d’étudier l’influx du Ba2+, nous avons suivi le même protocole décrit plus haut. Les cellules PLB-985 différenciées en présence de 1,25% de DMSO, ont été chargée avec la sonde fluorescente Indo-1 à la concentration de 4 µM pendant 45 min à l’abri de lumière. La sonde Indo-1 est excitée à 360 nm et les émissions de la fluorescence à 405 nm et 485 nm sont enregistrées. Ensuite, les concentrations intracellulaires en Baryum [Ba2+]cyt ont été calculées selon l’équation de Grynkiewicz:
[Ba
2+]
cyt=K
D’ ×
(Grynkiewicz et al., 1985)
.
KD’ est la constante de dissociation du complexe indo-1~Ba2+ = 780 nM à 37°C, R est le ratio
. Rmax est le ratio de la fluorescence lorsque la sonde indo-1 est saturée
par un excès de Baryum extracellulaire (10 mM de BaCl2) en présence de la ionomycine 1µM. Le Rmin est le ratio calculé en ajoutant dans la solution de l’EGTA à 10 mM et du triton 100X.
Le protocole consiste à stimuler les cellules en absence du Ca2+ extracellulaire avec le fMLF, WKYMVm ou la TG pour vider le RE de ses réserves calcique et provoquer ainsi l’ouverture des SOCs. Ensuite, le BaCl2 à la concentration de 5 mM a été ajouté permettant une entrée massive du Ba2+.
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS
MATERIEL ET METHODES
62
VIII.
M
ESURE DE L’
INFLUX DUM
ANGANESELe manganèse (Mn2+), un cation divalent, comme le Ba2+ a la particularité d’entrer dans la cellule par la même voie que le Ca2+ sans être éliminé par la cellule. Mais aussi la spécificité du Mn2+ est d’éteindre la fluorescence de Fura-2 quand on excite au point isobestique à 360 nm. L’émission de la fluorescence est mesurée à 510 nm. Ceci nous a permis d’éliminer la partie efflux et ne mesurer que l’influx réel. Les cellules PLB-985 différenciées (106 de cellules/ml) ont été traitées par la TG, fMLF ou le WKYMVm pour vider le RE de ses réserves en Ca2+, ensuite, 300 µM de MnCl2 sont ajoutés pour induire l’influx de Manganèse qui correspond à l’abaissement de la fluorescence (effet quenching).
Pour permettre de quantifier l’influx du Mn2+ et comparer l’effet des analogues du 2- APB sous différents types de stimulations, nous avons calculé la pente de l’influx (sur une durée de 40 secondes).
IX. SYNTHESE D’INTERLEUKINE-2(IL-2)
Les expériences de la mesure des effets des analogues du 2-APB sur la synthèse de l'IL-2 ont été réalisées par (Bouchaïb Lamkhioued et Sophie Catherine Gangloff, faculté de
pharmacie, Université de Reims Champagne-Ardenne). Les cellules Jurkat (1 x 106 de cellules/ml) ont été incubées dans une plaque de 96 puits avec de la PHA 10 mg/ml avec ou en absence de 10 µM des analogues de 2-APB. Ensuite le surnageant est collecté et les quantités de l’IL-2 ont été quantifiées par une technique ELISA en utilisant le kit Quantikine Human IL-2 Immunoassay (R&D Systems Europe, Lille, France). Le principe consiste à recouvrir les puits par un 1er anticorps monoclonal spécifique pour l’IL-2. Ensuite lorsque les cellules rajoutées aux puits sont stimulées par la PHA, les quantités d’IL-2 produites sont détectées par un 2ème anticorps conjugué à une enzyme HRP qui catalyse la formation d’un produit final dont
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS
MATERIEL ET METHODES
63 l’absorbance est mesurée à 450 nm. Elle traduit la quantité de l’IL-2 produit par les cellules Jurkat.
X. TEST TUNNEL
Une des caractéristiques de l’apoptose est la fragmentation de l’ADN. Pour mettre en évidence une éventuelle mort cellulaire par apoptose, un test de fragmentation d’ADN ou test TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling) a été réalisé par (Isabelle DOIGNON et Olivier DELLIS, Université Paris-sud).
XI. MESURE SIMULTANEE DE LA PHAGOCYTOSE ET LA
PRODUCTION DES FRO A L’INTERIEUR DU PHAGOSOME
Le but de l’étude était de pouvoir mesurer simultanément la proportion de PLB-985 différenciées internalisant les levures Saccharomyces cerevisiae et les FRO produites à l’intérieur des phagosomes formés. Afin de réaliser ces expériences, les levures ont été doublement marquées par les sondes Alexa Fluor 405 et DCFH2 pour suivre respectivement la phagocytose et la production des FRO.