Enfin, l’étape finale est d’étudier les effets des analogues sur le SOCE des PLB-985 différenciées en cellules proches de neutrophiles. Ainsi que ses conséquences sur leur fonctionnement cellulaire en particulier la production de FRO et la phagocytose des levures. La phagocytose des levures par les cellules PLB-985 différenciées et la production de FRO intra-phagosomales seront étudiées grâce à la cytométrie en flux. Par ailleurs, la mesure des FRO produites au niveau extracellulaire est réalisée par chimiluminescence.
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MATERIEL
ET
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS
MATERIEL ET METHODES
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MATERIEL ET METHODES
V. CULTURE CELLULAIRE
A. L
IGNEEJURKAT
La lignée de cellules Jurkat E6.1 est une lignée de cellules provenant du sang périphérique d’un enfant de 14 ans souffrant d’une leucémie aigue à lymphocytes T (Schneider et al., 1977). Ces cellules ont été maintenues dans un milieu RPMI-1640 (Lonza, Verviers, Belgique) supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et 2 mM de la L-Glutamine (Invitrogen, Cergy-pontoise, France). Elles ont été incubées à 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2. Le repiquage des cellules Jurkat se fait deux fois par semaine pour maintenir la densité cellulaire entre 0,2. 106 et 2. 106/ml.
B. L
IGNEEPLB-985
La lignée cellulaire myéloïde humaines PLB-985 provient de chez Dr Marie-José
Stasia, CHU de Grenoble, France avec l’autorisation du Dr Mary Dinauer, Indiana University school of medecine, Indianapolis, IN, Etats-Unis. Les cellules PLB-985 ont pour
origine le sang périphérique d’une femme de 38 ans souffrant d’une leucémie aigüe myéloblastique réfractaire non lymphocytaire. L’intérêt de cette lignée est la capacité des cellules à se différencier vers des stades matures de granulocytes ou monocytes/macrophages selon le type de traitement induit (Tucker et al., 1987). Le travail notamment de Pedruzzi a achevé cette caractérisation en montrant les conséquences fonctionnelles de cette différenciation en cellules mimant les fonctions des neutrophiles suite aux diverses stimulations physiologiques comme :
CARACTERISATION DES CANAUX CALCIQUES DANS LES POLYNUCLEAIRES
NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS
MATERIEL ET METHODES
54 2. Le processus de dégranulation avec génération de granules azurophiles produites suite à la sensibilisation des neutrophiles « phénomène de priming » suivie par les granules spécifiques et les gélatinases et enfin les vésicules sécrétoires (Wright et al., 2010, Pedruzzi et al., 2002).
1. C
ROISSANCE DESPLB-985
Les cellules PLB-985 ont été maintenues dans le milieu RPMI-1640 supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2 mM de la L-Glutamine, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de la streptomycine et 0,25 µg/mL d’Amphotéricine B. Elles sont incubées à 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2. Le repiquage des cellules se fait deux fois par semaine pour maintenir la densité cellulaire entre 0,2. 106 et 2. 106/ml.
2. D
IFFERENCIATION DESPLB-985
Les PLB-985 ont été différenciées en cellules proches de neutrophiles qui sont capables à la fois de phagocyter les particules et produire des formes réactives de l’oxygène (FRO). Cette différenciation vers la voie granulocytaire est réalisée en incubant les cellules en présence de 1,25 % de diméthyl sulfoxyde (DMSO, Sigma- Aldrich) dans le milieu de culture. Le jour de la différenciation correspond à J0, et les expériences ont été réalisées à J5 ou J6 correspondant au stade mature des PLB- neutrophiles. Le milieu de culture est changé en J2 ou J3 (Pedruzzi et al., 2002).
VI. MESURE DES CONCENTRATIONS DU CALCIUM CYTOSOLIQUE
Les mesures de la [Ca2+]cyt ont été réalisées par une technique spectrofluorimétrique. Les cellules ont été centrifugées à 377 g pendant 5 min pour éliminer le milieu de culture. Ensuite elles ont été resuspendues dans un tampon PBS (Phosphate Buffer
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NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS
MATERIEL ET METHODES
55 (ASB) (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France). Les cellules ont été chargées en présence de 2 mM de CaCl2 avec 4 µM de indo-1-AM ou Fura-2-AM selon les expériences (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, Etats-Unis), des sondes fluorimétriques perméables. Les cellules ont été chargées pendant une heure à température ambiante avec la sonde fluorescente sous sa forme ester acétoxy méthyl, à l’abri de la lumière et sous faible agitation. La sonde diffuse à travers la membrane et elle est clivée par les estérases intracellulaires pour générer ensuite la sonde fluorescente. Ensuite, pour éliminer les sondes restant à l’extérieur des cellules, ces dernières ont été lavées deux fois avec un tampon Hepes sans calcium (Hepes Buffered
Saline, HBS) dont la composition en mM est la suivante : 135 NaCl, 5.9 KCl, 1.2
MgCl2, 11.6 Hepes, 11.5 glucose, pH à 7.3 ajusté avec une solution de NaOH 1M.
Pour procéder à la mesure de la [Ca2+]cyt , 106 de cellules sont diluées dans un volume final de 2 mL et déposées dans une cuvette en quartz (Hellma® Fluorescence cuvettes, Sigma-Aldrich, France). La cuvette est insérée dans un spectrofluorimètre (VARIAN® Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer) relié à un bain marie pour maintenir les cellules à 37°C. Le spectrofluorimètre est piloté par le logiciel Cary Eclipse Kinetics Applications. Pour maintenir les cellules en suspension en cuvette, un agitateur aimanté est placé au fond de la cuvette.
Après une excitation à 360 nm de la sonde Indo-1, les émissions de la fluorescence à 405 nm (calcium lié à l’indo-1) et à 485 nm (calcium libre) sont enregistrées. Ensuite, les concentrations intracellulaires en calcium [Ca2+]cyt sont calculées selon l’équation de Grynkiewicz:
[Ca
2+]
cyt=K
d×
(Grynkiewicz et al., 1985)
.
Le KD est la constante de dissociation du complexe indo-1~Ca2+ = 230 nM à 37°C, R est le ratio
, Rmax est le ratio de la fluorescence lorsque la sonde indo-1 est
saturée par un excès de calcium extracellulaire (10 mM de CaCl2) en présence d’un ionophore (ionomycine 1µM). Le Rmin est le ratio calculé dans les conditions
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NEUTROPHILES : ROLE DANS LA PHAGOCYTOSE ET LA PRODUCTION DE ROS
MATERIEL ET METHODES
56 minimales de [Ca2+]cyt en ajoutant dans la solution de l’EGTA à 10 mM, un chélateur de Ca2+ et du Triton 100X.
Pour les expériences réalisées avec la sonde Fura-2, les cellules sont excitées à deux longueurs d’onde 340 nm et 380 nm et l’émission de la fluorescence est mesurée à 510 nm.