Drogue - L’antagoniste du B1R, le SSR240612 a été synthétisé par Sanofi-Aventis R&D,
Montpellier, France (Gougat J. et al. 2004). Lors des expériences in vivo, le composé a été dissout dans de l’eau contenant 2% dimethylsulfoxide [DMSO] afin d’obtenir une solution à 1g/L. Cette solution a ensuite été diluée dans de l’eau distillée et administrée par gavage à la
dose de 10mg/kg [concentration finale en DMSO 0,01%]. Le véhicule est donc une solution aqueuse de DMSO 0,01%.
Animaux - Les souris ont été hebergées dans un lieu indemne de tout pathogène. Toutes
les expériences ont été menées en accord avec les directives du NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoires et ont été approuvées par un comité local d’utilisation des animaux.
Les souris invalidées pour le B1R ont été obtenues comme décrit précedemment (Pesquero J.B. et al. 2000). Briévement, les souris ont été générées par ciblage génique dans un fond génétique mixte 129/SvJ x C57Bl/6J, puis rétrocroisées 10 fois dans un fond C57B/6J [Harlan]. Les souris contrôles sauvages étaient de fond génétique C57Bl/6J et achetées chez Harlan.
Obstruction urétérale unilatérale - Des souris mâles sauvages ou invalidées pour le B1R
de 8 semaines ont été utilisées pour ces expériences. Les souris sont anesthésiées à l’aide d’un mélange oxygène-isoflurane. Puis, une incision longitudinale est effectuée sur la paroi abdominale gauche. L’uretère gauche est exposée et ligaturée au niveau de la jonction pyélo- urétérale à l’aide d’un fil de nylon 6/0. Les souris sham subissent la même procédure à l’exception de la ligature. Les souris sont maintenues sous un régime alimentaire standard. Les traitements avec le B1Ra sont initiés soit 1 jour avant, soit 3 jours après l’obstruction, puis poursuivis tous les jours pendant les 8 jours d’OUU. À la fin des protocoles, les souris ont été sacrifiées et les reins récupérés et divisés en plusieurs parties selon les différentes techniques employées.
Transplantation de moelle osseuse – Des souris receveuses mâles sauvages de 8
semaines ont été irradiées létalement à 10 Gy, puis sont maintenues en conditions stériles et sous eau acide [pH 2] supplémentée en antibiotiques [100 mg/L néomycine et 60 000 U/L polymyxin B sulfate ; Invitrogen]. La moelle osseuse est isolée à partir de fémurs et de tibias de souris sauvages ou invalidées pour le B1R de 12 semaines. Les cellules sont dissociées par passage dans une aiguille 21G, centrifugées [250 g, 5 minutes, 4°C] puis resuspendues dans du RPMI 1640 [GIBCO], 2% sérum de veau fœtal et 5 U/L héparine. Les souris receveuses ont recu 5.106 cellules de moelle osseuse injectées en intra-veineuse dans la veine caudale. L’OUU est réalisée 4 semaines après la transplantation.
Glomérulonéphrite induite par le sérum néphrotoxique - Le protocole et la préparation
du NTS que nous avons utilisés ont déjà été décrits précédement (Lloyd C.M. et al. 1997). Brievement, des souris mâles CD-1 de 6 semaines ont été préimmunisées par une injection
sous-cutanée de 200
µ
g d’IgG de brebis [Sigma] dans de l’adjuvant complet de Freuds [Sigma]. Cinq jours plus tard, les souris sont immunisées par une injection intra-veineuse de 50 µL de NTS, pour 3 jours consécutifs, dans la veine de la queue (Lloyd C.M. et al. 1997). Les souris sont maintenues sous un régime alimentaire standard. Le traitement par le B1Ra est commencé 2 semaines après l’induction de la pathologie et poursuivi jusqu’à la fin des 6 semaines. À la fin des protocoles, les souris ont été sacrifiées et les reins récupérés et divisés en plusieurs parties selon les différentes techniques employées. Le plasma a été collecté afin de mesurer la créatinine plasmatique [Creatinine CP, from HORIBA-ABX] à l’aide du système COBAS Mira Plus.Biopsies rénales humaines - Nous avons rétrospectivement analysé des coupes en
paraffine de biopsies rénales issues de patients adultes et pédiatriques ayant été diagnostiqués entre 2001 et 2005. Chaque patient, ou leurs parents dans le cas des patients pédiatriques, ont signé un consentement informé afin qu’une partie de leur biopsie soit utilisée à des fins scientifiques. Toutes les procédures et les manipulations des tissus ont été effectuées selon les directives éthiques françaises.
Culture cellulaire - Les cellules HEK293 sont maintenues dans du DMEM sans pyruvate
et avec 4,5g/L de glucose et 10% de sérum de veau fœtal [GIBCO] à 37°C, 5% CO2. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits puis transfectées de manière transitoire à l’aide d’un plasmide pcDNA3 contenant le gène codant pour le B1R humain [BDKB10TN00 ; Missouri S&T cDNA Ressource Center] en utilisant le réctif de transfection JetPEI [Ozyme]. Deux jours plus tard, les cellules sont prétraitées ou non à l’aide de l’antagoniste peptidique humain du B1R, la des-arg10, leu9 kallidine (10-6M) [NeoMPS] pendant 15 minutes, puis traitées par l’agoniste peptidique humain du B1R des-arg10 kallidine (10-6M) [NeoMPS] pendant 4 heures.
Analyse histologique et immunohistochimie - Des coupes en paraffine de 4
micromètres ont été utilisées pour des marquages de routine [Periodic Acid Schiff, PAS et rouge sirius] et pour l’immunohistochimie. Toutes les biopsies humaines ont été scorées de 0 à +++ par un anatomo-pathologiste expert afin d’évaluer l’inflammation. Pour l’immunohistochimie, les coupes de reins humains ou de souris ont été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans une série de bains d’éthanol avant de subir un blocage des peroxydases endogènes. Les anticorps primaires ont été incubés pendant 1 heure à température ambiante : anti-B1R humain K21N au 1/2000ème (Schanstra J. et al. 1998), anti- αSMA [DAKO Epos method], anti-collagène III au 1/500ème [Interchim], anti-F4/80 au 1/250ème
[Caltag laboratories]. Puis les lames ont été incubées avec les anticorps secondaires et contrecolorées à l’hématoxyline.
Les analyses histomorphométriques ont été réalisées à l’aide d’un logiciel commercial d’analyse d’images permettant de reconstruire une section de rein à partir de photos individuelles adjacentes [Explora Nova Mosaïc Software]. La quantification des croissants glomérulaires a été effectuée par une analyse en aveugle et en comptant au minimum 100 glomérules sur des coupes colorées au PAS. Seuls les glomérules ayant 2 couches ou plus de cellules dans la capsule de Bowman ont été comptés positifs. L’atrophie tubulaire a été identifiée par l’épaississement et la perte de régularité des membranes basales.
Extraction des ARN, synthèse des ADNc et PCR en temps réel - Les ARN totaux ont
été isolés à partir des reins de souris ou des cellules HEK293 à l’aide du QIAGEN RNeasy Mini Kit, élués dans 20 μL d’eau RN’ase-free puis traités à la DN’ase (TURBO DNA-free kit, AMBION). La concentration des ARN a été déterminée à l’aide d’un NanoDrop [spectophotomètre ND-1000]
.
Cent nanogrammes d’ARN ont été utilisés pour la synthèse d’ADNc à l’aide du High Capacity cDNA Archive Kit [Applied Biosystems].La PCR en temps réel a été effectuée à l’aide d’un système ABI PRISM 7900 HT dans un mix contenant 25 ng d’ADNc, 300 nM de primer sens, 300 nM de primer anti-sens et du Power SYBR Green PCR Master Mix [Applied Biosystems].
Analyse statistique - Les données sont exprimées en moyenne plus ou moins écart-type.
Pour les comparaisons entre plusieurs groupes, nous avons utilisé un test ANOVA et un post- test de Tuckey. Des valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.