Comme nous l’avons vu dans la partie introductive, la progression de l’inflammation et de la fibrose est intimement liée à la production de diverses cytokines. Ainsi, les chimiokines sont impliquées dans le recrutement des cellules inflammatoires au site de la lésion, participant ainsi à l’initiation et à la progression de la fibrose. De plus, les cytokines pro-fibrosantes, telles que le TGF-β et le CTGF sont de forts inducteurs de l’apparition des myofibroblastes et des promoteurs centraux de la synthèse de MEC. Nous nous sommes donc demandé si le B1R pouvait moduler l’expression de ces cytokines.
Le blocage du B1R est associé à une diminution de l’expression du CTGF, de CCL2 et de CCL7 dans l’OUU - Nous avons analysé l’expression de cytokines et de chimiokines clés
connues pour être impliquées dans l’inflammation et la fibrose : le TGF-β, le CTGF, CCL2, CCL5, CCL7 et CXCL5.
Le blocage du B1R est sans effet sur l’expression du TGF-β dans ce modèle (figure 20a). Néanmoins, nous avons pu mettre en évidence que l’augmentation de l’expression du CTGF au cours de l’OUU était réduite par le traitement retardé à l’aide du B1Ra (figure 20a). Ce résultat supporte l’étude précédente de Ricupero et al, démontrant que l’activation du B1R induisait une stabilisation de l’ARNm du CTGF et ainsi, une augmentation de son expression, dans des myofibroblastes in vitro (Ricupero D.A. et al. 2000).
De plus, nous avons montré que le traitement par le B1Ra bloquait significativement l’expression de CCL2, CCL7 (figure 20b) et CXCL5 (résultat non montré) dans ce modèle. En revanche il est sans effet sur l’expression de CCL5 (résultat non montré).
Figure 20. Le traitement retardé par l’antagoniste du B1R bloque la surexpression du CTGF, de CCL2 et de CCL7 induite par l’OUU. Nous avons analysé l’expression des ARNm des cytokines pro-fibrosantes TGF-β et CTGF et des chimiokines CCL2 et CCL7 par PCR en temps réel après 8 jours d’OUU chez des souris traitées par le véhicule (barres blanches) ou des souris traitées par le B1Ra (barres noires). *p<0,05 versus sham. #p<0,05 versus OUU 8 jours sans B1Ra. n=10 souris/groupe. UUO8d : OUU 8 jours.
La stimulation du B1R induit directement l’expression du CTGF, de CCL2 et de CCL7 dans les cellules HEK293 - Afin de mieux comprendre les mécanismes d’action du B1R, nous
avons regardé si la stimulation du B1R pouvait activer directement l’expression des cytokines et des chimiokines par les cellules rénales. Pour cela, nous avons utilisé des cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney) transfectées par le B1R humain et stimulées par son agoniste, la des-arg10kallidine [B1Rago]. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que la stimulation du B1R dans ces cellules induisait l’expression du CTGF, de CCL2 et CCL7 et cet effet est inhibé par l’antagoniste peptidique du B1R [B1Ra, des-arg10leu9 kallidine] (figure 21). Aucun effet n’a été
observé sur l’expression du TGF-β [résultat non montré].
Figure 21. La stimulation du B1R induit l’expression du CTGF, de CCL2 et de CCL7 dans les HEK293. Des cellules HEK293 ont été traitées par l’antagoniste des-arg10leu9 kallidine [B1Ra] pendant 15 min. puis par l’agoniste du B1R, la des-arg10kallidine [B1Rago] pendant 4 h. L’expression des ARNm du CTGF, de CCL2 et de CCL7 a été analysée par PCR en temps réel. *p<0,05 versus cellules non stimulées. #p<0,05 versus B1Rago. n=3.
Le B1R présent sur les cellules inflammatoires n’est pas impliqué dans la progression de l’inflammation et le développement de la fibrose dans l’OUU - Lors de
l’inflammation, les chimiokines sont synthétisées à la fois par les cellules résidentes rénales
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b
b
lésées, mais également par les cellules inflammatoires, qui participent ainsi à l’amplification du phénomène. Or, en conditions pathologiques, le B1R peut être exprimé aussi bien par les premières, que par ces dernières. Afin de définir si l’effet anti-fibrosant et anti-inflammatoire du blocage du B1R passe par une action sur les cellules résidentes rénales ou bien sur les cellules inflammatoires infiltrées, nous avons réalisé, grâce à des expériences de transfert de moelle osseuse, une invalidation sélective du gène du B1R présent dans les cellules inflammatoires. Pour cela, des souris sauvages irradiées ont été greffées à l’aide de moelle osseuse issue de souris invalidées pour le gène du B1R [RB1-/- Bone Marrow, RB1-/- Bm], puis soumises à l’OUU. Après 8 jours d’OUU, nous avons analysé l’effet de ce « knock-out conditionnel » sur l’expression des chimiokines CCL2 et CCL7, sur l’infiltration des macrophages et sur l’accumulation de MEC.
Les souris RB1-/- Bm n’ont présenté aucune différence significative dans l’augmentation de ces paramètres par rapport aux souris reconstituées par de la moelle osseuse de souris sauvages [WT Bm] (figure 22). Ces résultats, associés à ceux qui sont obtenus in vitro (figure
21), suggèrent donc fortement que l’effet du B1R sur le développement de la FTI dans ce
modèle passe principalement par une action directe sur les cellules résidentes rénales en modulant l’expression des chimiokines, ce qui, en retour, module l’infiltration des cellules inflammatoires et ainsi, la fibrose.
Figure 22. L’absence du B1R sur les cellules issues de la moelle osseuse n’affecte pas le développement de la fibrose dans les souris sauvages soumises à l’OUU. Des souris sauvages reconstituées avec de la moelle osseuse sauvage [WT Bm] ou de la moelle osseuse issue de souris invalidées pour le B1R [RB1-/- Bm] ont été soumises à 8 jours d’OUU. Puis l’expression des ARNm de CCL2 et de CCL7 a été quantifiée par PCR en temps réel, et l’infiltration de cellules inflammatoires et l’accumulation de MEC ont été quantifiées par un marquage immunohistochimique anti-F4/80 et un marquage au Rouge Sirius respectivement. *p<0,05 versus sham. n=7 souris/groupe. ECM : MEC ; UUO8d : OUU 8 jours.
C. VALIDATION DANS UN MODÈLE DE GLOMÉRULONÉPHRITE INDUITE PAR LE