1.1 Culture cellulaire
Les cellules MRC-5 (cellules fibroblastiques embryonnaires de poumon humain), les cellules CaCo-2 (adénocarcinome colorectal humain), les cellules HeLa (adénocarcinome du col de l’utérus humain) et les cellules HEK 293T ont été cultivées dans du milieu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium ; (219-010; Wisent) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal. Les cellules NHDF (fibroblastes dermiques) ont été cultivées dans le milieu FBM (fibroblast growth basal medium ; CC3131; Lonza). Les cellules NMuMG (cellules épithéliale murines de la glande mammaire) ont été cultivées dans du milieu DMEM complété avec 10% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine (Wisent), 10 mM d’HEPES pH 7.4 and 10 μg ml−1 insuline. Les cellules HUVEC (cellules endothéliales
vasculaires ombilicales humaines) ont été maintenue en culture dans le milieu EGM2 (endothelial cell growth medium 2 ; CC3156; Lonza). L’ensemble de ces cellules sont maintenues en chambre humide thermostatée à 37C, 5% CO2. Les cellules MDA-MB-231
(cellules humaine du cancer du sein hautement métastatique) et les cellules MDA-MB-468 (cellule humaine du cancer du sein faiblement métastatique) sont maintenues en culture dans du milieu Leibovitz’s L-15 (41300-039; Gibco) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et maintenues à 37°C sans ajout de CO2 en chambre humide.
Les cellules sont maintenues en culture par passage successif par trypsination (325-043 EL ; Wisent) sans jamais atteindre la confluence jusqu’à un maximum de 6-10 passages.
1.2 Les anticorps
Les anticorps utilisés au cours de ce travail sont répertoriés dans le tableau 2.1. Il est également indiqué la dilution d’utilisation de chaque anticorps en fonction des méthodes utilisées.
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Tableau 2.1 : Liste des anticorps utilisés et dilution d’utilisation.
Dilution de travail
Nom Fournisseur Référence W.B I.F
Anticorps primaire
4E-BP1 Cell Signaling Technology 9644 1/5000
p-4E-BP1 (Ser65) Cell Signaling Technology 9456 1/1000
AKT Cell Signaling Technology 9614 1/1000
Claudine-1 Cell Signaling Technology 13255 1/1000
E-cadhérine Cell Signaling Technology 3195 1/1000
eIF2α Cell Signaling Technology 9722 1/1000
p-eIF2α (Ser51) Cell Signaling Technology 9721 1/500
FMRP Fournier et al., 2013 1/1
G3BP1 Gallouzi et al., 1998 1/2000 1/1000
GAPDH Cell Signaling Technology 5174 1/1000
GST Cell Signaling Technology 2625 1/100
HSP70 Cell Signaling Technology 4872S 1/1000
N-cadhérine BD Bioscience 610920 1/1000
Paxillin BD Bioscience 610052 1/200
Puromycine clone 12D10 EMD millipore MABE343 1/25000 1/12500
RhoA Cell Signaling Technology 2117 1/1000
RxxS/T-P Cell Signaling Technology 9614 1/1000
Sam68 Chen et al., 1999 1/2000 1/200
Slug Cell Signaling Technology 9585 1/500
Twist Santa Cruz sc-81417 1/500
Vimentine BD Bioscience 550513 1/10000
Vinculine Sigma-Aldrich V9131 1/400
α-actinine Cell Signaling Technology 6487 1/1000
β-actine Cell Signaling Technology 8457 1/2000
β-caténine Cell Signaling Technology 8480 1/1000
Anticorps secondaire
Anti-IgG de souris-HRP Cell Signaling Technology 7076 1/5000
Anti-IgG de lapin-HRP Cell Signaling Technology 7074 1/5000
Anti-IgG de souris-Alexa 488 Cell Signaling Technology 4408 1/500
Anti-IgG de lapin-Alexa 488 Cell Signaling Technology 4412 1/500
Anti-IgG de souris-Alexa 555 Cell Signaling Technology 4409 1/500
69 1.3 Les inhibiteurs
Les différents inhibiteurs utilisés sont indiqués dans le tableau 2.2 avec leur concentration respective.
Tableau 2.2 : Liste des différents inhibiteurs et leur concentration d’utilisation.
Nom Fournisseur Référence Concentration
Puromycine (application SunSET) Bio-Basic PJ593 10 µg/mL Puromycine (Test d'adhésion) Bio-Basic PJ593 2,5 µg/mL
Cycloheximide Sigma-Aldrich 01810-5G 50 µg/mL
Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG 10 µM
Anisomycine Sigma-Aldrich A5862-0.5ML 10 µg/mL
ISRIB Sigma-Aldrich SML0843 1µM
PP2 Sigma-Aldrich P0042-5MG 100 nM
1.4 Constructions plasmidiques Pour ce travail, les plasmides suivant ont été utilisés :
- Le plasmide lentiviral pLKO.1 puro (addgene # 8453) permet l’expression de shRNA (short hairpin RNA). Ces derniers ont été clonés par les sites de restriction AgeI et EcoRI. Le tableau 2.3 indique la séquence des différents shRNA utilisés.
Tableau 2.3 : Liste des shRNA et de leur séquence.
Cible Séquence (5' => 3') Sam68 CCGGGAGCAAAGTTGTTACTGATTTCTTGCTCGAGCAAGAAATCAGTAACAACTTTGCTCA TTTTTTG G3BP1 CCGGACATTTAGAGGAGCCTGTTGCTGAACTCGAGTTCAGCAACAGGCTCCTCTAAATGT TTTTTG RhoA CCGGTGGAAAGACATGCTTGCTCATCTCGAGATGAGCAAGCATGTCTTTCCATTTTTG Contrôle CCGGGCGCGATAGCGCTAATAATTTCTCGAGAAATTATTAGCGCTATCGCGCTTTTTG
La séquence soulignée représente la séquence cible
- Le plasmide lentiviral pLJM1 (Addgene #19319) a permis l’expression de la eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), du gène de résistance à la puromycine dans les cellules HUVECs, de l’expression des mutants Sam68 et de l’expression du facteur de transcirption Twist dans les lignées MDCK (Madin-Darby Canine Kidney cells) et NMuMG. L’ADNc de Twist a été cloné par PCR dans le pLJM1 à partir du plasmide pBabe-puro- mTwist (Addgene #1783) via les sites de restriction AgeI et EcoRI. L’ADNc de Sam68 a été cloné par PCR à partir de l’ARNm et inséré dans le plJM1 par les site NheI et EcoRI. Les mutants ont été créé par mutagénèse dirigée.
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- Le plasmide lentiviral pLJM1 a également été utilisé pour réaliser les expériences d’hybridation in situ en fluorescence (FISH : fluorescence in situ hybridization), afin d’exprimer la eGFP. Cependant, à la suite de la séquence eGFP un site de polyadhénylation (séquence BGH) a été ajouté. Les 3’UTR des différents ARNm ont été clonés entre la séquence eGFP et BGH.
- Pour la production des lentivirus, les plasmides psPAX2 (Addgene #12260) et pMD2.G (Addgene #12259) ont été utilisés.
- Le plasmide pGEX-4T-3 a été utilisé et la portion de ROCK2967-1085 humain a été clonée par
PCR au niveau des sites de restriction BamHI et EcoRI.
1.5 La microscopie
Pour cette étude, les microscopes utilisés sont :
- le FV1000 (confocal laser-scanning, Olympus) équipé d’un objectif 60X (1.42 NA, splan APO) contrôlé par le logiciel FluoView. L’acquisition des images a été effectuée sur des cellules fixées à température ambiante.
- le Nikon Eclipse Ti-E à fluorescence équipée d’un objectif 20X ou 60X. Ce microscope équipé d’une chambre thermostatée à 37C, 5% CO2 a permis l’acquisition des vidéos en
temps réel. De plus, il a également été utilisé pour acquérir les images à fluorescence des chambres de boyden et d’adhésion avec la fonction « plan large » (8 champs par 8 champs avec l’objectif 20X). Ce microscope est contrôlé par le logiciel NIS-Element.
Les réactifs utilisés pour ces études sont répertoriés dans le tableau 2.4
Tableau 2.4 : Liste des réactifs fluorescents.
Nom Fournisseur Référence I.F
Oligo(dT)30-Alexa 594 IDT 125nM
Phalloïdine Biotium 00040 / 00042 1/500 Dapi Sigma-Aldrich D9542 1 µg/mL Sonde EGFP Stellaris VSMF-1014-5 125nM 1.6 Les réactifs, matériels et équipements
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Tableau 2.5 : Liste des réactifs.
Réactifs/Matériels/Équipements Compagnie Numéro de
catalogue Commentaires/Description
DMEM Wisent 319-005-CL
EGM2 (endothelial cell growth medium 2 ; CC3156;
Lonza) Cedarlane CC-3162
Leibovitz’s L-15 Invitrogen 41300-039
Trypsine Wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
FluoroDish World Precision Instruments F35-100
Cellules MRC-5 ATCC CCL-171
Cellules HeLa ATCC CCL-2
Cellules MDA-MB-231 ATCC HTB-26
Cellules MDA-MB-468 ATCC HTB-132
Cellules CaCo-2 Cedarlane HTB-37
Cellules NHDF Lonza CC-2509
Cellules MDCK ATCC CCL-34
Cellules NMuMG Laboratoire Nicolas Bisson-Université Laval -
Cellules HUVECs Cedarlane C2519A
Fv1000 Olympus - Système d'imagerie confocale
Fiji software - - http://fiji.sc
PBS (Phosphate buffered saline) Bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution Bio-Basic C5300-1
Triton X-100 Bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500
Formamide Sigma F5786
Rnase murin inhibteur New England Biolabs (NEB) M0314L
ROCHE complete EDTA Sigma 4693159001
ARNt Sigma 10109541001
Chambre de boyden Fisher 7200149
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