Évaluation de l'activité traductionnelle lors de l'adhésion et l’étalement cellulaire

La traduction joue un rôle important dans la mise en place de l’architecture du cytosquelette d’actine à partir des SICs et dans le métabolisme de cette structure, car elle y est majoritairement localisée. Nous avons donc voulu évaluer l’activité traductionnelle globale lors de l’adhésion cellulaire. Pour cela, nous avons effectué un profil polysomal à différents temps d’adhésion. Ce profil permet de nous renseigner sur la répartition des ribosomes aux différentes étapes de la traduction (figure 3.24). Les polysomes correspondent aux ribosomes qui sont en cours de traduction et le blocage de l’élongation de la traduction par l’utilisation de la cycloheximide ou de l’anisomycine aboutit à une augmentation de la fraction polysomale. Le 80S, quant à lui, correspond à l’initiation de la traduction et bloquer cette étape de la traduction par les drogues comme l’harrigtonine induit une perte de la fraction polysomale et une augmentation de l’entité 80S.

Nous pouvons observer que la répartition du profil polysomal change au cours du temps d’adhésion. En effet, à 10 minutes d’adhésion, nous perdons une grande proportion des polysomes par rapport aux cellules en suspension et aux cellules étalées (figure 3.24-A, B et F). Cependant, cette fraction polysomale augmente à nouveau au cours du temps au fur et à mesure que l’adhésion se déroule (figure 3.24-C, D et E). De plus, nous pouvons noter que la répartition des entités 40S, 60S et 80S évolue également au cours de l’adhésion. En effet, à 10 minutes d’adhésion, la fraction 80S diminue fortement au profit des fractions 40S et 60S par rapport aux cellules en suspension et étalées indiquant une diminution de l’initiation de la traduction (figure 3.24-A, B et F). Cependant, le rapport entre les entités 40S, 60S et 80S tendent à se rééquilibrer au profil du 80S comme c’est le cas pour les cellules étalées ou en suspension (figure 3.24-C, D et E). Ainsi, lorsque les cellules sont

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étalées, le profil polysomal tend à être celui des cellules en suspension. Ces résultats indiquent donc que l’état traductionnel de la cellule se modifie lors de l’adhésion.

Figure 3.24 : Modification de l’activité traductionnelle lors de l’adhésion.

Profils polysomaux de cellules MRC-5 à différents temps lors de l’adhésion. Les extraits cytoplasmiques de cellules MRC-5 ont été préparés lorsque ces cellules étaient en suspension (A) ou adhérées à 10 minutes (B), à 40 minutes (C), à 60 minutes (D), à 90 minutes (E) et à 360 minutes (F). Ils ont été déposés sur un gradient de sucrose et le profil polysomal a été mesuré par l’absorbance à 254 nm. Le 40S correspond à la petite sous-unité ribosomale, le 60S à la large sous- unité ribosomale et le 80S au ribosome associé sur l’ARNm. Ensemble, ils correspondent à la fraction des monosomes. Les fractions des polysomes correspondent au ribosome en cours de traduction.

Nous avons quantifié ces différents profils afin d’évaluer les changements polysomaux. Nous pouvons observer une diminution de 45% de l’activité traductionnelle entre les cellules

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en suspension et les cellules à 10 minutes d’adhésion (figure 3.25-A). Par la suite, l’activité traductionnelle raugmente comme observé précédemment dans la figure 3.24. Pour confirmer cette augmentation de l’activité traductionnelle lors de l’adhésion, nous avons utilisé la puromycine afin de l’évaluer (figure 3.25-B). Nous pouvons observer que l’intensité de la traînée protéique s’accentue au cours du temps indiquant que l’activité traductionnelle va en augmentant durant le processus d’adhésion et d’étalement.

Figure 3.25 : Diminution de l’activité traductionnelle lors des premières étapes de l’adhésion.

Évaluation de l’activité traductionnelle lors de l’adhésion. A) L’aire de la fraction des polysomes qui correspond au ribosome en cours de traduction a été calculé et rapporté à l’aire totale du profil polysomal. Cela a été effectué pour chaque temps d’adhésion en triplicata. B) Immunobuvardage de type western d’extraits cellulaires de MRC-5 à différents temps d’adhésion traitées pendant 5 minutes à la puromycine (10 µg/mL) afin d’évaluer l’activité traductionnelle de ces cellules lors de ce processus. Les immunobuvardages de COX IV et AKT joue le rôle de contrôle de charge. La barre d’erreur représente l’écart type. Valeur du test de Student bilatéral *** ≤0.001

La répression globale de la traduction est principalement contrôlée soit par la phosphorylation d’eIF2α soit par l’absence de phosphorylation de 4E-BP1. Nous nous sommes intéressé dans un premier temps à la phosphorylation d’eIF2α et nous avons mesuré ses niveaux au cours du temps lors de l’adhésion (figure 3.26). Comme nous pouvons le constater, lors des premières étapes de l’adhésion, il y a une augmentation de plus de deux fois du niveau de phosphorylation d’eiF2α au temps 10 et 20 minutes post adhésion par rapport au cellules en suspension puis ce niveau de phosphorylation diminue dans les temps suivant. Ce profil de phosphorylation dans le temps concorde avec le profil de l’activité traductionnelle.

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Figure 3.26 : Augmentation de la phosphorylation d’eIF2α lors des premières étapes de l’adhésion.

Immunobuvardage de type western d’extraits cellulaires de MRC-5 à différents temps d’adhésion. La forme phosphorylée d’eIF2α et la forme totale de cette même protéine (panneau de droite) ont été révélées. Graphique de la quantification de la forme phosphorylée d’eIF2α sur la forme totale. Valeur moyenne de 4 réplicats. La barre d’erreur représente l’écart type. Valeur du test de Student bilatéral * ≤0.05, ** ≤0.01

Ainsi, nous montrons que lors des premières étapes de l’adhésion, il y a une diminution de l’activité traductionnelle qui concorde avec la phosphorylation de eIF2α. Cet évènement transitoire dans le temps semble associé à une réinitialisation de l’initiation de la traduction laissant suggérer une reprogrammation de la traduction afin de favoriser la synthèse de protéines spécifiques.

2.4 Identification des protéines synthétisées lors de l'adhésion cellulaire