Matériels et méthodes

a) Réactifs

Le tampon phosphate salin (PBS), le milieu Williams E, la solution saline équilibrée de Han

(HBSS), la pénicilline-streptomycine, et la L-glutamine ont été obtenus chez Life

Technologies (Eugene, OR, USA). Le sérum de veau fœtal (FCS) a été obtenu chez Hyclone

(Logan, UT, USA). L’insuline, l’hydrocortisone, l’α- et la β-amanitine, l’acide formique et

l’acétate d’ammonium ont été obtenus chez Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le kit de

dosage d’ATP a été obtenu chez Abcam (Cambridge, MA, USA). La sonde de détection d’ion

superoxide MitoSOX a été obtenue chez ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, USA). La

virginiamycine, utilisé comme étalon interne (EI), a été obtenu chez Santa Cruz

Biotechnology (Dallas, TX). Le méthanol, l’acétonitrile et l’eau ont été obtenues chez Fisher

Scientific UK (Loughborough, Leicestershire, UK). L’ammoniac a été obtenu chez Probalo

(Paris, France). Tous les réactifs et solvants utilisés dans le cadre des dosages d’amanitine

sont certifiés de qualité LC-MS.

b)Mise au point du dosage des amanitines par LC-MS/MS

a. Instruments de mesure

Les analyses ont été réalisées sur un spectromètre de masse Thermo Scientific Q Exactive

^TM

(San Jose, USA) couplé à une pompe Accela (Thermo Scientific, San Jose, USA). Un

électrospray HESI-II a été utilisé pour la ionisation des composés d’intérêt. L’acquisition des

données, l’intégration des pics et la calibration ont été réalisés à l’aide du logiciel Xcalibur®

135

b. Paramètres de chromatographie liquide

La séparation par chromatographie liquide a été réalisée sur une colonne Accucore C18 (100

mm x 2.1, 2.6 µm). L’éluant correspond à un mélange de solvant A (Acétate d’ammonium 10

mM, acide formique 0.1%) et de solvant B (Acétonitrile, acide formique 0.1%). La

chromatographie dure 6 minutes à un débit constant de 500 µL/min suivant plusieurs

gradients d’élution. Le gradient débute par un mélange constitué de 91% de solvant A – 9%

de solvant B de 0 à 0,5 minutes puis évolue jusqu’à une composition de 95% de solvant B –

5% de solvant A de 0,5 à 1,5 minutes. Ce mélange est maintenu de 1,5 à 4 minutes, avant de

finir par un mélange constitué de 91% de solvant A – 9% de solvant B de 4 à 6 minutes pour

l’équilibrage. Tous les échantillons ont été gardé à 15°C dans l’autosampler jusqu’à injection

de 20 µL dans la colonne thermostatée à 30°C du système LC-HR-MS (boucle partielle).

c. Paramètres MS

Les paramètres MS sont les suivants : HESI en mode positif, température du capillaire: 300

°C; voltage du spray: 3500 V; débit de sheath et gaz auxiliaire (azote): 40 psi et 10 (unité

arbitraire), respectivement. Les données ont été obtenues en mode ciblé SIM (Single Ion

Monitoring). Les paramètres ont été optimises par infusion directe des molécules d’intérêt

individuellement (α-amanitine et virginiamycine) à une concentration de 1 mg/L dans la phase

mobile et injecté dans la sonde d’ionisation à un débit de 500 µL/min en mode ionisation

positive. La résolution a été fixée à 140 000 FWHM et l’AGC Target était de 2e

5

. Le

« Maximum injection time” était de 503 ms et l’isolation width de 4.0 m/z. Les valeurs

mesurées des composés protonnés étaient de 919,3614 m/z et 867,4055 m/zpour l’α-amanitine

et la virginiamycine, respectivement. En mode PRM, l’ion parent pourra être fragmenté en

ions fils caractérisé par son rapport m/z par un flux d’argon avec une énergie de collisions

normalisée à 50 eV pour l’α-amanitine et 30 eV pour la virginiamycine. Les transitions

919,3614 → 259,1287 m/z et 919,3614 → 339,1183 m/z ont été sélectionnées pour l’α

-amanitine et la transition 867,4055 → 663,2773 m/z a été sélectionnée pour la virginiamycine.

La quantification a été obtenue par extraction des masses exactes de chaque composé

protonné, ainsi que de leurs fragments protonnés en utilisant une fenêtre de détection de 5

ppm.

136

d. Solutions standards

La solution mère d’α-amanitine, a été préparée dans de l’eau bidistillée (1.0 g/L) et stockée à

-20°C. L’étalon interne a été préparé dans du méthanol (1.0 g/L) et stocké à -20°C.

e. Préparation des échantillons

Les échantillons d’urine de patients, de surnageants de culture et de lysats cellulaires (500 µL)

ont été supplémentés avec 20 µL d’EI à 100 ng/mL (20 ng/mL de virginiamycine dans le vial

final) et extraits par extraction en phase solide (SPE). Après dilution des échantillons dans 1

mL de tampon de dilution (acide formique 1% ; pH=2), sonication pendant 10 minutes et

centrifugation 10 minutes à 4000 g, les surnageants ont été instillés sur une colonne C18 Bond

Elut Agilent C18 (200 mg, 3mL) préalablement conditionnée avec 2 mL de méthanol, 2 mL

d’eau distillée et 2 mL de solution tampon. Les colonnes ont ensuite été lavées avec 4 mL

d’eau LC-MS après passage des échantillons. Les analytes ont ensuite été élués avec 3 mL de

méthanol à 2% d’ammoniaque. Les surnageants ont ensuite été évaporés jusqu’à l’obtention

d’un résidu sec sous un flux d’azote à 50°C. Les résidus ont été dissous dans 200 µL de phase

mobile et transférés dans des vials pour l’analyse par LC-HR-MS/MS.

c) Cultures cellulaires et traitements

a. Cellules HepaRG

Les cellules HepaRG progéniteurs ont été cultivées comme précédemment décrit (Aninat et

al. 2006). Brièvement, les cellules HepaRG ont été ensemencées à une densité de 2.6 × 10

⁴

cellules/cm

²

en plaque de 96 puits dans du milieu William’s E supplémenté avec 10 % de

Sérum de Veau Fœtal (SVF), 50 U/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine, 5 µg/mL

d’insuline, 2 mM de glutamine, et 50 μM d’hémisuccinate d’hydrocortisone. Après deux

semaines, les cellules ont été cultivées pendant deux semaines supplémentaires dans le même

milieu supplémenté avec 2 % de DMSO afin de provoquer la différenciation des hépatocytes

et obtenir un fort niveau d’expression des fonctions hépatiques spécifiques. Après quatre

semaines, les cultures obtenues sont différenciées en cholangiocytes et hépatocytes (Cerec et

al. 2007).

137

b. Cellules parentales HepG2

Les cellules HepG2, obtenues chez l’American Tissue Culture Collection (ATCC, Los Altos,

CA, USA) ont été ensemencées à une densité de 6.6x10

⁴

cellules/cm

²

dans des plaques de 96

puits dans du milieu MEM Eagle supplémenté avec 10 % de SVF, 50 UI/mL de pénicilline,

50 µg/mL de streptomycine et 4 mM de L-glutamine. Les cellules ont été utilisées quatre

jours après l’ensemencement.

c. Traitement des cellules

Les trois types cellulaires (HepaRG progéniteurs, HepaRG différenciés et HepG2) ont été

incubés en présence d’amanitines à différentes concentrations dans le but de déterminer la

concentration toxique pour 50 % des cellules (0,2 à 100 µM).

d) Viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire de nos différents modèles de cellules hépatiques a été évaluée à l’aide

d’un kit de dosage d’ATP luminescent (Abcam, Cambridge, MA, USA). Brièvement, le

milieu de culture a été enlevé après 24 h de traitement et les cellules ont été rincées avec 100

µL de PBS à température ambiante, avant de les incuber pendant 30 minutes avec 100 µL de

milieu William's sans rouge de phénol. Le réactif ATP reconstitué selon les instructions du

fabricant (100 µL) a été ajouté dans chaque puit.

Les plaques ont ensuite été agitées pendant trois minutes sur un agitateur orbital (300 rpm) à

l’abri de la lumière puis laissées 10 minutes à reposer. Cent microlitres de chaque puit ont été

transférés dans une plaque de 96 puits opaque afin de les lire au lecteur de microplaque

(POLARstar Omega

^®

, BMG labtech

^®

, Ortenberg, Allemagne).

138

e) Mesure du stress oxydant

La sonde MitoSOX (ThermoFisher Scientific, MA, USA) a été utilisée pour mesurer la

production des ROS mitochondriaux. Brièvement, après 24 h de traitement, les cellules ont

été incubées avec 100 µL de sonde MitoSox (5 µM) pendant 30 minutes à 37°C et 5% CO2 à

l’abri de la lumière. Le milieu de culture a ensuite été retiré et les cellules lavées une fois avec

100 µL de HBSS à température ambiante.

La fluorescence des plaques multi-puits a ensuite été lue à l’aide du lecteur de plaque

(POLARstar Omega®, BMG labtech®, Ortenberg, Allemagne) et les données ont été

analysées à l’aide du logiciel MARS (BMG labtech®, Ortenberg, Allemagne). Les résultats

ont été normalisés à l’aide d’un dosage de protéines dans les puits respectifs (Pierce BCA

protein assay Kit®, ThermoFisher Scientific®, Allemagne).

f)Analyses statistiques

Les données sont exprimées en moyenne ± écart type. Les différences intergroupes en

fonction des traitements ont été analysées par un test “one-way analysis of variance »

(ANOVA), avec un post test de Bonferroni pour les comparaisons de groupes. Toutes les

analyses ont été effectuées à l’aide du logiciel Prism (version 5.0, Logiciel GraphPad, La

Jolla, CA, USA). Les seuils de significativité ont été fixés à p < 0.05.

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Dans le document Xénobiotiques hépatotoxiques : études de métabolisme et mécanismes d’action (Page 154-159)