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1.Méthodologie
1.1 Type d'étude
Il s'agit d'une étude descriptive transversale partielle basée sur l'analyse des données recueillies, portant sur un échantillon du cancer de la glande mammaire chez la femme jeune caractérisé par son agressivité agissant sur la réduction de la survie globale. A travers cette étude nous tenterons de dresser un portrait épidémiologique, génétique et clinique du cancer du sein précoce dans l'Est Algérien qui mérite un intérêt particulier.
1.2 Population d'étude
Notre série de l'étude porte sur 135 patientes, le recrutement de ces patientes s'est effectué de février 2012 à décembre 2013, au sein de l'unité d'oncologie médicale du centre anti cancéreux de Constantine Dr BENBADIS (59 cas), de Batna (39 cas) et celui de Sétif (40 acs), Algérie. Le suivi des patientes sélectionnées a été prolongé jusqu'au mois de juin 2015.
La recherche de mutations germinales des gènes BRCA1 et BRCA2 a porté sur 100 patientes dont 30 cas sont suivies au niveau du service d'oncologie médicale du centre anti cancéreux de Constantine, 30 cas au niveau de Batna et 40 cas au niveau de Sétif. Leur recrutement s'est effectué du mois d'avril 2012 à décembre 2013. Le suivi des patientes retenues a été prolongé jusqu'à novembre 2016.
1.3 Critères d'inclusion et d'exclusion
Les critères d'inclusion retenus pour cette étude sont:
Femmes Algériennes diagnostiquées avec un carcinome du sein primitif histologiquement prouvé.
Femmes âgées de quarante ans et moins. Femmes résidant à l'Est algérien.
Femmes ayant répondu au questionnaire. Les critères de non inclusion sont:
Les lymphomes et les sarcomes
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Concernant l'étude génétique, en plus des critères d'inclusion, les patientes retenues doivent présenter:
Un carcinome du sein primitif invasif histologiquement prouvé.
Toute femme ne répondant pas à l'un de ces critères d'inclusion ou présentant:
Une tumeur in situ. Un autre cancer.
Une maladie infectieuse contagieuse.
Une maladie psychiatrique majeure, a été écartée de la population cible.
1.4 Aspect éthique
Un consentement éclairé écrit a été obtenu avant toute procédure de prélèvement sanguin auprès de toutes les participantes à cette étude (Annexe 2).
1.5 Méthodes de collecte de données
Une pré-enquête exécutée en janvier 2012 auprès de 30 femmes atteintes d'un cancer du sein a été procédée afin de tester la faisabilité et le timing du questionnaire destiné à la collecte de données dans le but d'obtenir un questionnaire clair et compréhensible.
La collecte de données a été effectuée à travers une interview fondée sur un questionnaire validé. Ce questionnaire nous a permis de recueillir des données importantes sur les patientes retenues, il s'agit notamment des paramètres démographiques (âge, statut matrimonial, ...), reproductifs et gynécologiques (âge des premières règles, âge de première grossesse, la notion d'allaitement, utilisation des contraceptifs oraux, nombre d'enfants...), le statut psychologique et les antécédents médicaux, chirurgicaux et familiaux ainsi que le mode de vie et les habitudes alimentaires (nombre de repas/jour, consommation excessive de viande,...) et toxiques (notion de tabac, notion d'alcool,...) des patientes incluses (Annexe 1).
C'est à travers les dossiers médicaux et les comptes rendus histopathologiques, sources de données importantes que nous avons pu collecter les caractéristiques tumorales afin de compléter notre questionnaire.
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1.6 Mesure de l'IMC
L'IMC a été mesuré à l'aide des deux variables anthropométriques (taille et poids) afin d'évaluer la corpulence et le degré de la surcharge pondérale selon la formule suivante:
IMC = Poids (kg) / Taille² (m²)
L'IMC nous a permis de classer les patientes en différentes catégories (sous-nutrition, normale, surpoids, obésité classe I, obésité classe II et obésité morbide) selon les recommandations de l'OMS (2011).
1.7 Mesure de la survie
Les dossiers médicaux ont été également consultés afin de recueillir les données sur la survie de patientes. La survie globale étant définie par l'intervalle de temps entre le diagnostic initial et la date de la dernière consultation ou la date de décès.
1.8 Antécédents familiaux
Pour chaque patiente un arbre généalogique a été établi à l'aide du logiciel GenoPro 2016, suite à un questionnaire.
1.9 Méthode d'analyse
1.9.1 Recherche des mutations BRCA1 et BRCA2 1.9.1.1 Séquençage direct
Le séquençage des gènes BRCA1/2 a été effectué en plusieurs étapes. La première consiste à l'extraction d'ADN; l'ADN des patientes algériennes atteintes du CCI précoce non sélectionnées pour une histoire familiale de cancer du sein et/ou de l'ovaire, provenant de 100 familles algériennes non apparentées, a été examiné à la recherche de mutations des gènes BRCA1 ou BRCA2. L'ADN génomique lymphocytaire a été extrait à partir du sang périphérique total prélevé dans un tube EDTA Vacutainer de 5 ml, deux prélèvements ont été retenus pour chaque patiente (Annexe 3, 4). Ensuite, tous les exons codants et immédiatement les régions introniques adjacentes des deux gènes sont amplifiés par des réactions d'amplification par PCR, suivi du séquençage de type Sanger bidirectionnel, la réaction de séquençage est effectuée en utilisant la trousse BigDye® Primer Cycle Sequencing V3.1 et le séquenceur 3730xl (Life Technologies) pour la détection des mutations de petite taille, ainsi que les grands réarrangements génomiques par la technique
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MLPA dans le cas où une petite mutation pathogénique n'a pas été détectée (un résultat négatif) au niveau de tous les exons du gène BRCA1 (OMIM 113705/GenBank entry U14680) et BRCA2 (OMIM 600185/GenBank entry U43746). (Integrated BRACAnalysis® de Myriad Genetic Laboratories) (Annexe 5,6). La technique MLPA est réalisée en trois étapes (Annexe 8).
Approximativement, 5400 paires de bases constituant les 22 exons du gène BRCA1 et d'environ 750 paires de base adjacentes dans les séquences non codantes ont été examinés dans les deux directions sens et anti sens. Les exons non codants 1 et 4 ne sont pas analysés. En outre, approximativement 10,200 paires de base composant les 26 exons du gène BRCA2 et d'environ 900 paires de base adjacentes dans les régions introniques. L'exon 1, qui est un exon non codant n'a pas été analysé.
Les gènes BRCA1 et BRCA2 possèdent des exons de grande taille ne permettant pas une analyse par séquençage en une seule fois. Donc ils sont fragmentés en plusieurs amplicons d'environ 200 bases, donnant l'exemple de l'exon 11 de BRCA1 (12 amplicons) et les exons 10 (4 amplicons), 11 (15 amplicons), 14, 18, 25 et 27 (2 amplicons) de
BRCA2.
1.9.1.2 Analyse des courbes de fusion à haute résolution
En plus du séquençage direct quelques échantillons ont été analysés à l'aide de la technique HRM ou l'analyse des courbes de fusion à haute résolution (Annexe 7). Cette technique permet de mettre en évidence la présence de variantes génétiques (polymorphisme et mutation). L'amplification des fragments d'ADN génomique lymphocytaire couvrant la séquence codante et les jonctions introns-exons des gène
BRCA1/2 et l'analyse de ces fragments ont été effectués par précriblage en fusion haute
résolution. Son principe général est le suivant:
L'analyse commence en premier temps par une PCR classique afin d'amplifier le fragment d'ADN étudié. Si la région amplifiée présente une variation de séquence à l'état hétérozygote, deux fragments seront présents dans le produit de la PCR (allèle sauvage et muté). Cette étape est suivie d'une étape de dénaturation-renaturation afin de créer des hétéro et homoduplexes à partir des deux populations présentes dans la PCR. Les hétéroduplexes sont des doubles brins d'ADN formés d'un brin venant de l'allèle sauvage et d'un brin de l'allèle variant. La formation de ces fragments d'ADN entraine alors
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l'apparition d'un mauvais appariement à l'endroit où est localisée la variation de séquence. L'HRM détecte des variations génétiques mais sans les identifier par l'analyse de courbes de fusion sur le Light Cycler 480 en déterminant la température de fusion de différentes renaturations en comparaison avec le point de fusion d'un échantillon normal. C'est une technique de précriblage complet des gènes BRCA1 et BRCA2 permettant de ne séquencer dans un second temps que les variants en utilisant un séquençage direct.
1.9.2 Classification des variantes identifiées
La classification et l'interprétation de toutes les variantes identifiées chez les patientes de cette série reflètent les connaissances actuelles. Un test de confirmation des mutations BRCA détectées a été exécuté indépendamment par une répétition de l'amplification de la séquence identifiée pour chaque participante.
Toutes les variantes détectées ont été citées selon la nomenclature internationale du HGVS et elles ont été classées selon des différentes catégories: mutations délétères, suspectes délétères, variantes de signification clinique inconnue et les polymorphismes (BRACAnalysis® 2015). On a classé les mutations BRCA suspectes délétères et les délétères comme un résultat positif, les polymorphismes et l'absence de mutation comme un résultat négatif alors que les variantes de signification clinique inconnue ont été rapportées dans une catégorie séparée. Par ailleurs, les effets des variantes génétiques détectées ont été confirmés en utilisant "Mutalyzer 2.0.11". Les nouvelles variantes ont été soumises à la base de données LOVD.
1.9.3 Recherche de biomarqueurs salivaires
La salive est un liquide physiologique incolore alcalin sécrétée par les glandes salivaires (Humphrey et al., 2001), elle est constituée de 1166 protéines dont une proportion notable est similaire de celles retrouvées dans le plasma sanguin (Denny et al., 2008). Elle peut être utilisée comme un biomarqueur qui pourrait fournir une alerte précoce de plusieurs maladies y compris le cancer (Markopoulos et al., 1997; Chen et al., 2002; Lawrence et al., 2002, Schipper et al., 2007; Lee et al., 2009). L'établissement de tels biomarqueurs va certainement accélérer et améliorer le diagnostic de la maladie cancéreuse voire même être des marqueurs prédictifs ou pronostiques.
35
Le but de cette approche est d'investir la présence de différences dans la salive des femmes atteintes d'un cancer du sein diagnostiquées à l'âge de 40 ans, en associant leur profil salivaire à celui épidémio-génétique, des femmes présumées saines de la même catégorie d'âge et d'exploiter la modification du protéome salivaire qui se produit dans le cancer mammaire en biomarqueur salivaire du diagnostic de cette maladie cancéreuse. En outre, l'utilisation de biomarqueur sérique dans le suivi du cancer du sein métastatique est peu fiable, la mise en évidence d'autres biomarqueurs est nécessaire. De plus, les protéines salivaires sont le produit de gènes donc s'il y a un changement génétique probablement il sera exprimé dans la salive d'où l'idée d'étudier la différence entre un profil salivaire de patientes et celui de cas témoins. Il pourrait être un moyen de dépistage pour les femmes porteuses d'une mutation afin de détecter précocement sa survenue dans les familles à haut risque.
Des salives provenant de patientes Algériennes ayant un cancer du sein diagnostiqué à l'âge de 40 ans et moins ainsi que des femmes présumées saines de même âge ont été utilisées. La séparation et l'analyse des protéines salivaires a été effectuée en utilisant la technique d'électrophorèses monodimensionnelle.
1.9.3.1 Recrutement de participantes
15 femmes Algériennes issues de l'Est âgées de moins de 40 ans ont été retenues dont 3 sont des femmes indemnes. 12 patientes atteintes d'un cancer du sein sont suivies au service d'oncologie médicale de l'établissement hospitalier (EH) de Didouche Mourad de la wilaya de Constantine. La maladie cancéreuse a été confirmée par un examen histologique. Les patientes ne présentant pas une hygiène buccale correcte ont été exclues de l'étude. Cette série a été comparée à trois femmes indemnes du même âge que les femmes atteintes d'un cancer du sein, sans pathologie connue et ayant une bonne hygiène buccale.
1.9.3.2 Protocole de recueil de la salive
La salive examinée à été recueillie selon la méthode décrite par (Hirtz et al., 2005). La salive totale est prélevée le matin, d'environ deux heures après le petit déjeuner après un brossage des dents avec une brosse à dent dépourvue du dentifrice. Afin de favoriser la salivation, les participantes doivent boire un verre d'eau d'environ 15 minutes avant le prélèvement et mâcher un petit bout du parafilm durant quelques minutes. Trois ml de salive totale sont prélevés dans des Eppendorf stériles. Les échantillons salivaires sont
36
ensuite centrifugés à 10000xg pendant 15 minutes afin d'éliminer les mucines et les débris alimentaires. Le surnageant prélevé est immédiatement congelé à moins 20°C.
1.9.4 Extraction des protéines salivaires
L'extraction de protéines à partir de la salive totale des patientes et celle des témoins a été effectuée dans deux conditions différentes; des conditions dénaturantes et réductrices et dénaturantes non réductrices.
1.9.4.1 Dans des conditions dénaturantes et réductrices
100 µl de salive de patientes et celle des cas témoins ont été mélangées avec 75µl de solution d'extraction contenant 35% de glycérol (v/v), 22% de Tris/HCL 1 M pH 6.8 (v/v), 43% d'eau distillée, 7% de SDS (p/v), quelques grains de bleu de bromophénol. Pour réduire les protéines salivaires, 2.5% de β-Mercaptoethanol ont été rajoutés au mélange. Ensuite agiter 1 heure à température ambiante, les mélanges sont incubés à 65°C durant 30 minutes puis centrifugés à 10000 t/min pendant 1 minute. Les surnageants contenant les protéines salivaires dissociées et réduites sont récupérés. Agiter et incuber les échantillons dans les mêmes conditions. Les surnageants contenant les protéines salivaires non dissociées et non réduites ont été récupérées des Eppendorf stériles.
1.9.4.2 Dans des conditions dénaturantes et non réductrices
100µl de salive totale de patientes et celle des sujets témoins ont été prélevés, ils sont ensuite repris dans 75µl de solution d'extraction précédemment décrite mais sans l'agent réducteur le β-Mercaptoethanol .
1.9.5 Electrophorèse monodimensionnelle en gel de polyacrylamide
Le protéome salivaire de deux conditions d'extraction a été caractérisé par une migration électrophorétique en gel de polyacrylamide de 1.5 mm d'épaisseur avec un système de migration vertical.
L'électrophorèse est réalisée suivant la méthode de Laemmli UK et al (1970) modifiée par Singh NK et al (1991). L'utilisation de cette technique nécessite la préparation d'un gel de séparation permettant le fractionnement de différentes protéines selon leurs poids moléculaires, en favorisant leur séparation en sous unités distinctes, ainsi qu'un gel de concentration qui permet de retenir les impuretés et de tasser les protéines avant leur entrée dans le gel de séparation. Le gel de séparation contient 12.56% de polyacrylamide et le gel
37
d'alignement 2.88%. Les échantillons sont déposés à raison de 20 µl par puits. La migration est réalisée à 40mA par gel dans un tampon Tris 25 mM pH 8.3 contenant 1.4% de glycine 5 (p/v) et 0.1% de SDS (p/v). A la fin de la migration électrophorétique, le gel issu est révélé par une coloration en bleu de Coomassie à 12% de TCA (p/v) et 5% de solution mère de bleu (v/v) de Coomassie à 1% dans l'éthanol pendant une nuit, en conséquence les deux gels sont colorés, puis ils sont décolorés dans l'eau du robinet.
1.9.6 Lecture des électrogrammes
La lecture des profils électrophorétiques consiste à relever la différence entre les protéines salivaires de patientes et celles de sujets indemnes. La technique de l'électrophorèse utilisée permet d'obtenir l'ensemble des protéines.
1.10 Analyse statistique
Les données récoltées à travers cette étude, ont été saisies et analysé par le logiciel SPSS version 20.0 et Excel 2010.
1.10.1 Analyse univariée
Les résultats sont présentés sous forme de moyenne et écart type pour les variables quantitatives tandis que les variables qualitatives ont été exprimées en pourcentage.
1.10.2 Analyse bivariée
L'analyse bivariée a été réalisée par des tests paramétriques, dans le but d'éclairer l'association entre le cancer du sein et les différents paramètres qualitatifs grâce au test d'indépendance du Chi2 de Pearson ou le test de Fisher (selon les conditions de validité) en comparant les pourcentages et le test de Student ou l'ANOVA pour la comparaison des moyennes.
Les caractéristiques clinico-pathologiques et le statut mutationnel de BRCA ont été corrélés en utilisant le test de Chi-squared, les tests de corrélation de Pearson et Spearman et le test ANOVA à un seul facteur.
Le p value précise le degré de significativité statistique des tests, la différence est significative si p<0.05 et non significative si p>0.05. Les intervalles de confiance des moyennes ou des pourcentages sont à 95% (IC95%).
38
1.10.3 Courbe de survie
La courbe de survie a été tracée à l'aide du test non paramétrique Kaplan-Meier sur le logiciel SPSS version 20.0
39
Chapitre 3
Première partie: Approche épidémiologique
L'enquête portant sur 135 répondantes
1. Age des patientes
Les résultats obtenus montrent
tranche d'âge la plus touchée est celle allant de 36 à des cas, suivie de celle de 31
du diagnostic était de 36.29 ans population cible avait un âge
Figue.10
2. Appartenance géographique des patientes
La majorité des patientes dans cette série, sont d'origine sétifienne, avec une fré de l'ordre de 25.19%, suivis de 18.52%
originaires de la wilaya de Taref ne repré (Figure 11).
3. Origine géographique
Pour mieux caractériser les p
géographique par strate, en analysant les communes de résidence. La strate de notre
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 20-25 2 : Approche épidémiologique
sur 135 répondantes a permis d'obtenir les résultats suivants:
Les résultats obtenus montrent clairement que le cancer du sein frappe tous les âges touchée est celle allant de 36 à 40 ans, qui comptabilise
des cas, suivie de celle de 31 à 35 ans, soit 21.48% (Figure 10). L'âge moyen au moment du diagnostic était de 36.29 ans avec une étendue allant de 23 à 40 ans
population cible avait un âge ≤ 35 ans et plus de 55% des cas avaient un âge
Répartition des patientes selon la tranche d'âge.
Appartenance géographique des patientes
La majorité des patientes dans cette série, sont d'origine sétifienne, avec une fré de l'ordre de 25.19%, suivis de 18.52% des cas issus de la wilaya de B
wilaya de Taref ne représentent que 2.22% de la
Origine géographique
Pour mieux caractériser les participantes de notre étude, on a étudié l'origine géographique par strate, en analysant les communes de résidence. La strate de notre
26-30 31-35 36-40 15
29
89
40
a permis d'obtenir les résultats suivants:
e cancer du sein frappe tous les âges, la comptabilise plus de 65% ). L'âge moyen au moment une étendue allant de 23 à 40 ans. 34.7% de la 35 ans et plus de 55% des cas avaient un âge ≥ 38 ans.
Répartition des patientes selon la tranche d'âge.
La majorité des patientes dans cette série, sont d'origine sétifienne, avec une fréquence des cas issus de la wilaya de Batna. Les patientes sentent que 2.22% de la population d'étude
articipantes de notre étude, on a étudié l'origine géographique par strate, en analysant les communes de résidence. La strate de notre
population d'étude est présentée en deux catégories urbaine et rurale, comme le propose le graphe N°12 où la majorité des
Figure.11 Répartition des patientes selon l'appartenance géographique.
Figure.12 Répartition des patientes selon l'origine géographique.
25,19% 18,52% 8,15% 7,41% 5,93% 4,44% 74,07%
population d'étude est présentée en deux catégories urbaine et rurale, comme le propose le graphe N°12 où la majorité des patientes sont issues de la région urbaine.
Répartition des patientes selon l'appartenance géographique.
Répartition des patientes selon l'origine géographique.
25,19% 4,44% 4,44% 4,44% 4,44% 4,44% 3,70% 3,70% 2,96% 2,22% 17,04% 25,93% Origine rurale Origine urbaine 41
population d'étude est présentée en deux catégories urbaine et rurale, comme le propose le patientes sont issues de la région urbaine.
Répartition des patientes selon l'appartenance géographique.
Répartition des patientes selon l'origine géographique.
Setif Batna Constantine Khenchela Skikda Jijel Tebessa BBA Guelma OEM M'sila Mila Annaba Taref Origine rurale Origine urbaine
4. Statut matrimonial
L'analyse des données rapportées montre q dominant, soit 101 cas, seules 28 patientes 13).
Figure.13
5. Activité professionnelle
La répartition des patientes en fonction de l'activité plupart des cas touchés par cette lésion cancéreuse étaient au foyer" qui représentent
(Figure 14).
L'analyse approfondie de la
impressionnant: la majorité des femmes actives, diagnostiquées avec cette maladie patientes sont des couturières
secrétaires au nombre de 7 patientes (Figure 1
6. Niveau socioéconomique Les résultats rapportés par
catégorie moyenne sont atteintes par cette élevée.
20,74% 2,96%
s données rapportées montre que le groupe des patientes mariées est seules 28 patientes de notre échantillon étaient
Répartition des patientes selon le statut marital
Activité professionnelle
patientes en fonction de l'activité professionnelle
par cette lésion cancéreuse étaient des femmes inactives "femmes qui représentent 52.6% des cas, 24.4% sont des femmes de profession libérale.
L'analyse approfondie de la répartition socioprofessionnelle, aboutit à un résultat : la majorité des femmes actives, diagnostiquées avec cette maladie
sont des couturières appartenant à la catégorie "profession libéra de 7 patientes (Figure 15).
Niveau socioéconomique
rapportés par la figure 16 montrent que 75 patientes sont atteintes par cette maladie contre 41 patientes
74,81% 2,96% 1,48% Mariées Célibataires Divorcées Veuves 42
ue le groupe des patientes mariées est célibataires (Figure
tes selon le statut marital.
professionnelle révèle que la des femmes inactives "femmes femmes de profession libérale.