Matériel biologique Matériel biologique Matériel biologique Matériel biologique

Les espèces utilisées dans ce travail sont mentionnées dans le tableau III-1 (page suivante). Leur origine et leur matricule y sont notés.

B.

B.B.

B.

Protocoles d’eProtocoles d’eProtocoles d’eProtocoles d’extraction d’ADN xtraction d’ADN xtraction d’ADN et d’ARNxtraction d’ADN et d’ARNet d’ARNet d’ARN

1.

Dissection des animaux

Les animaux destinés à la dissection pour en extraire l’ADN sont préalablement lavés à l’eau de Javel diluée (3%) puis rincés à l’eau déminéralisée afin de réduire les contaminations par des micro-organismes présents sur la cuticule des animaux. De même, lors de la dissection des animaux, le tube digestif et les cæcums digestifs sont écartés afin d’éliminer les contaminations par les nombreux micro-organismes présents dans le système digestif. Les tissus prélevés pour les extractions d’ADN chez les femelles sont les ovaires, la chaîne nerveuse et quelques tissus musculaires et adipeux. Lors de la dissection de mâles, le prélèvement des utricules (contenant le sperme) est généralement proscrit afin d’éviter une composition trop visqueuse du broyat, rendant difficile l’extraction d’ADN. Toutefois, l’extraction d’ADNmt des utricules s’est révélée indispensable pour certaines expériences de ce travail.

2.

Extraction d’ADN total

Le protocole d’extraction d’ADN total des animaux est adapté de Kocher et al. (1989). La totalité du protocole est en annexe 1.

3.

Extraction d’ADN mitochondrial

La transmission uniquement maternelle des mitochondries nous a permis de cumuler l’ADNmt de plusieurs individus (généralement des femelles) issues de la même lignée maternelle. Pour cela, nous avons élevé des lignées maternelles de plusieurs espèces dans le laboratoire UMR 6556 de l’Université de Poitiers.

Le protocole d’extraction de l’ADNmt des Isopodes terrestres est adapté de la lyse alcaline proposée par Sambrook et al. (1989). Le principe de cette méthode destinée à l’origine à l’extraction de plasmides est d’isoler l’ADNmt des autres molécules d’ADN provenant de l’animal (ADN nucléaire) et de ses éventuels endosymbiotes dont Wolbachia

Matériels & méthodes

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Tableau III-1 : Espèces d’Isopodes utilisées dans ce travail. Les matricules correspondent à des

lignées entretenues au laboratoire.

SOUS-ORDRE

Famille Espèces Origine Matricule

ASELLOTA

Asellidae Asellus aquaticus Poitiers, Fr. FLABELLIFERA

Dynamene bidentata La Rochelle, Fr.

Sphaeroma serratum La Rochelle, Fr. ONISCIDEA

Armadillidae Armadillo officinalis Tq. Arm4

Cubaris murina Baie Mahault, Gp. Armadillidiidae Armadillidium depressum Ste Marie, Fr.

Armadillidium maculatum Eze, Fr.

Armadilldium nasatum Mignaloux, Fr. Camarade, Fr.

Armadillidium vulgare Tunis, Tu. ZP

Heraklion, Gr. ZM Celles sur Belle, Fr. ZN Nice, Fr. BF Porto Alegre, Br. RS São Paulo, Br. ZG Ribadeo, Es. AL Helsingør, Dk. WX Chizé, Fr.

Eluma purpurescens Chizé, Fr. Balloniscidae Balloniscus sellowii Caxias do Sul, Br. Cyliscticidae Cylisticus convexus Villedaigne, Fr. Halophiloscidae Halophiloscia couchii La Rochelle, Fr. Ligiidae Ligia oceanica La Rochelle, Fr. Oniscidae Oniscus asellus Edinburgh, UK

Oniscus lusitanus Fr.

Philoscidae Atlantoscia floridana Porto Alegre, Br.

Chaetophiloscia elongata Celles sur Belle, Fr.

Philoscia muscorum La Mothe St Héray, Fr. Platyarthridae Platyarthrus hoffmannseggii Chizé, Fr.

Platyarthrus caudatus Scopello, It.

Trichorhina tomentosa Baie Mahault, Gp. Porcellionidae Porcellio laevis Fr.

Porcellio scaber Le Havre, Fr.

Porcellio gallicus Montpellier, Fr.

Porcellio dilatatus dilatatus Rom, Fr. Trachelipodidae Trachelipus rathkii Cosnes sur Loire, Fr.

Tylidae Helleria brevicornis Ste Marguerite, Fr.

Br. : Brésil, Dk. : Danemark, Es. : Espagne, Fr. : France, Gp. : Guadeloupe, Gr. : Grèce, It. : Italie, Tq. : Turquie, Tu. : Tunisie, UK : Grande Bretagne.

Matériels & méthodes

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(ADN bactérien estimé à plus de 1 Mb - voir Sun et al. 2001), grâce à sa taille nettement plus faible que les autres. La totalité du protocole est en annexe 2.

Après le prélèvement des tissus de l’animal, ceux-ci sont plongés dans un tampon d’extraction adapté aux Crustacés terrestres : le STE (Sodium Tris-EDTA ; voir sa composition en annexe 2). Le tube contenant le tampon d’extraction est placé dans la glace pour éviter la dégradation de l’ADN.

Les tissus sont ensuite broyés à l’aide d’un Dounce de type B auxquels on y ajoute par la suite le tampon de lyse (composition de ce tampon en annexe 2). L’ADNmt est ensuite lavé puis repris dans de l’eau bidistillée.

4.

Extraction d’ARN

Un pool de plusieurs femelles issues de la même lignée maternelle est réalisé afin d’obtenir un maximum d’ARN. Les tissus gonadiques et nerveux des animaux sont broyés dans un mortier rempli d’azote liquide. La poudre obtenue est mélangée à un tampon de lyse, et un volume de phénol saturé en eau. La composition du tampon de lyse est :

- 10 mM Tris-HCl - 10 mM MgCl2

- 1% SDS

Après un deuxième lavage au phénol, afin d’éliminer le maximum de débris cellulaires, l’extraction d’ADN/ARN est précipité avec une solution 1 M d’Acétate de sodium (0,1 volume) et 2,5 volumes d’éthanol 100%. Après centrifugation, le culot d’ARN (contenant également de l’ADN) est repris dans de l’eau RNAse free.

Matériels & méthodes

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A

B

Figure III-1. Interprétation des profils de restriction de l’ADNmt atypique d’A. vulgare. A : exemple de profil à

quatre bandes issu d’une digestion sur un seul site de restriction (enzyme EcoRV). B : exemple de profil à cinq bandes issu d’une digestion sur deux sites de restriction (enzyme BamHI). D’après Raimond et al. (1999).

Figure III-2. Dénaturation du produit de digestion d’ADNmt atypique. La piste A

présente le profil de restriction de l’ADNmt d’A. vulgare digéré par EcoRV. La piste B présente ce même profil ayant subit une dénaturation avant la migration. Les deux bandes issues des dimères migrent à une taille deux fois plus petite (flèches). D’après Raimond et al. (1999).

Matériels & méthodes

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C.

C.C.