173
Annexe 6 : Protocole de séquençage Big Dye Terminator 174 Annexe 7 : Code génétique mitochondrial des Arthropodes 175 Annexe 8 : Structures secondaires des ARNtPro et ARNtAla/Val d’
A
.vulgare
identifiés par ARWEN
176
Annexe 9 : Séquences des ARNt potentiels identifiés à vue sur la séquence mitochondrial d’
A. vulgare
177
Annexe 10 : GC-skews des gènes mitochondriaux d’
A.vulgare
,L.
oceanica
etI. baltica
178
Annexe 11 : Chromatogrammes et digestions enzymatique de l’hétéroplasmie des Oniscidea
179
Annexe 12 : Code génétique mitochondrial de
L. oceanica
etI. baltica
184 Annexe 13 : Utilisation des codons dans le génome mitochondrial d’A.
vulgare
185
Annexe 14 : Comparaison des ARNtAla mitochondriaux d’
A. vulgare
et deL. oceanica
186
Annexe 15 : Phylogénie des Isopodes proposée par Wilson (2009) 187 Annexe 16 : Différentes phylogénies des Péracarides 188
Annexes
169
Annexe
Annexe Annexe
Annexe 1111 : Protocole d’extraction d’ADN total: Protocole d’extraction d’ADN total: Protocole d’extraction d’ADN total: Protocole d’extraction d’ADN total
1. Nettoyer les animaux dans un bain de Javel 3%, puis les rincer 2 à 3 fois à l’eau
déminéralisée, les déposer dans une boite (avec papier absorbant humide).
2. Préparer des tubes Eppendorfs avec 5µL de protéinase K + 400µL de tampon Wilson.
Composition du tampon Wilson :
- Tris 100 mM - EDTA 10 mM - NaCl 100 mM - SDS 0,1% - Dithiothréitol 50 mM - pH = 8
3. Dissection : récupérer les tissus dans les tubes déposés dans la glace ; broyer à l’aide d’un
pilon.
4. Incuber au bain-marie à 37°C pendant 4h.
5. Ajouter ½ volume de Phénol (200µL) et ½ volume de Chloroforme isoamyle (200µL), agiter.
6. Centrifuger à 12000 rpm pendant 8 minutes à 15°C.
7. Récupérer le surnageant.
8. Répéter les étapes 5 à 7
9. Ajouter 1 volume de Chloroforme isoamyle (400µL), bien agiter,
10. Centrifuger à 12000 rpm pendant 8 minutes à 15°C
11. Récupérer le surnageant.
12. Précipiter en ajoutant de l’Acétate de Na 3M pH 7 : 1/10 de volume (40µL) et 1 volume
d’isopropanol (400µL), bien agiter.
13. Laisser une nuit à -20°C
14. Centrifuger à 15000 rpm pendant 30 minutes à 4°C
15. Vider le tube (l’ADN est culotté)
16. Rincer deux fois avec 500µL d’éthanol 70%, centrifuger si le culot est décollé, vider
17. Laisser sécher sous la hotte (environ 30 minutes)
18. Ajouter 100µL d’eau stérile
Annexes
170
Annexe 2
Annexe 2Annexe 2
Annexe 2 : Protoco: Protoco: Protoco: Protocole d’extraction d’ADNmtle d’extraction d’ADNmtle d’extraction d’ADNmtle d’extraction d’ADNmt (Lyse Alcaline) (Lyse Alcaline) (Lyse Alcaline) (Lyse Alcaline)
STE : NaCl 0,1 M
Tris 10 mM
EDTA 1 mM
pH 8
filtré 0,2 µm
① Les animaux sont lavés dans l’eau de Javel 3% puis rincés.
Mettre les tissus frais dans 250 µl STE dans un eppendorf sur glace.
② Broyer au Dounce de taille B. Le broyat (1 volume) est déposé dans un nouvel eppendorf : 350 µl max. pour eppendorf de 1,5 ml et 450 µl pour eppendorf de 2 ml.
Rincer avec 100 µl STE.
③ Ajouter 2 volumes de : 0,2 M NaOH à partir de NaOH 10 N
1% SDS fraîchement préparé
Homogénéiser 5 fois doucement par retournement du tube. Laisser 2 à 3 min dans la glace. ④ Rajouter 1,5 volume (du volume initial) de tampon acétate K :
60 ml acétate K, 5 M
11,5 ml acide acétique glacial
28,5 ml H2O
pH 5,2
filtré 0,2 µm
Homogénéiser 5 fois par retournement du tube. Laisser 3 min dans la glace.
⑤ Centrifuger 5 min à 4°C, à 12000 t.min-1
. Répartir le surnageant en aliquots de 600 µl.
⑥ Lavage phénol (2 fois) : ajouter 1 volume de phénol (phase d’attente possible). Agiter doucement les
tubes et centrifuger 3 min à 15°C, à 12000 t.min-1. Prélever le surnageant.
⑦ Lavage au chloroforme-isoamyle (24 vol. chloroforme pour 1 vol. alcool isoamylique) : ajouter 1
volume de chloroforme-isoamyle. Agiter doucement et centrifuger 3 min à 15°C, à 12000 t.min-1.
Prélever le surnageant.
⑧ Ajouter au volume final : 1/10ème acétate de Na, 3 M, pH 7
2 vol. éthanol 100%
Homogénéiser doucement et mettre à -20°C au moins 1h pour précipiter (phase d’attente possible).
⑨ Centrifuger 30 min à 4°C, à 15000 t.min-1
.
⑩ Eliminer le surnageant et rincer le culot avec 500 µl d’éthanol 70% froid. Centrifuger rapidement et recommencer le rinçage à l’éthanol.
Sécher les culots sous la cloche à vide pendant 30 min.
Reprendre les culots dans un volume adéquat de H2O (1 µl / cloporte).
Annexes
171
Annexe
Annexe Annexe
Annexe 3333 : Protocole de Southern blot: Protocole de Southern blot: Protocole de Southern blot: Protocole de Southern blot
1. Préhybridation de la membrane
- Réhydrater la membrane dans une solution 2 mM EDTA, 0,1% SDS (filtrée à 0,2 µM) ; - Après réhydratation, pré-hybrider la membrane 2 heures à 42°C avec un tampon
d’hybridation + 400 µl de ssDNA (4mg/ml) fraîchement dénaturé (5 min. à 95°C puis 5 min. dans la glace).
Composition du tampon d’hybridation : - 40 g de Dextran Sulfate - 4 ml de ssDNA (2mg/ml)
- 160 ml de Formamide Désionisé - 80 ml de SSC 20X
- 4 ml de Tris 2M (pH 7,4) filtré au papier Whatman #1 - 4 ml de Denhardt’s 100X
- 150 ml d’eau bidistillée 2. Préparation de la sonde
- Diluer ~100 ng de produits de PCR dans un volume finale de 22,5 µl, puis dénaturer ce produit 5 min. à 95°C, puis 5 min. dans la glace ;
- Ajouter ensuite sur glace : - 5 µl de solution 1 (4mg/ml BSA + 30 OD/ml Random hexamères)
- 20 µl de solution 2 (0,5 M HEPES pH 6,6 + 12 mM
MgCl2 + 25 mM β-mercaptoéthanol + 12 mM Tris pH8 + 1
µl de chaque dNTP 100 mM ; H2O qsp 1 ml)
- 2 µl d’élément radioactif [α-32P]dCTP
- 0,8 µl de Klenow Polymerase (9U/µl)
- Incuber une heure à 37°C ;
- Arrêter la réaction avec 20 µl d’EDTA 0,5 M et 130 µl d’H2O ;
- Dénaturer la sonde marquée 5 min. à 95°C puis 5 min. dans la glace ; 3. Hybridation de l’ADN avec la sonde
- Remplacer le tampon de pré-hybridation par le tampon d’hybridation (même
composition que précédement) avec 400 µl de ssDNA (4mg/ml) fraîchement dénaturé et la sonde, pour une incubation de 16 heures à 42°C ;
4. Lavages de la membrane
- Après avoir enlevé le tampon d’hybridation, faire 2 bains de 2X SSC, 0,1% SDS, de 30 min. à température ambiante ;
Annexes
172
Annexe
Annexe Annexe
Annexe 4444 : Programme: Programme: Programme: Programmessss PCR et séquences des amorces utilisé PCR et séquences des amorces utilisé PCR et séquences des amorces utilisé PCR et séquences des amorces utiliséeseseses
Protocole d’amplification par PCR de la région non-codante de l’ADNmt d’A. vulgare : Programme de PCR : - 3 min. 95°C - 30 sec. 95°C - 1 min. 30 54°C - 1 min. 30 72°C - 5 min. 72°C Amorces :
CytbVD : CTACCTTGAGGTCAAATATC (située du coté du gène Cytb) VD1 : GAGATAAGTCGTAACAAAGTAG (située du coté du gène 12SARNr)
Protocole d’amplification par PCR pour l’étude de la synténie : Programme de PCR : - 3 min. 95°C - 30 sec. 95°C - 1 min. 30 50-55°C - 1 min. 30 72°C - 5 min. 72°C
Amorces comprises dans les gènes 16SARNr et Cox1 : IIIF : TTATGCTACCTTAGCACAGT
IIIR : TAAATCTGATCATCTCCAAT
Amorces comprises dans les gènes Cox3 et 12SARNr :
IVF : CCMCTATTAAATACTGCWAT (M = bases A ou C ; W = bases A ou T) IVR : GAGAGTGACGGGCGATATGT
Amorces comprises dans les gènes Nad5 et Nad4 :
IIF : CTATAACTAARAGRGCTCA (R = bases A ou G) IIR : GCTAATATAKCTTATGAACG (K = bases T ou G)
Protocole d’amplification par PCR pour tester la présence de Wolbachia par le gène wsp : Programme de PCR : - 2 min. 95°C - 1 min. 95°C - 1 min. 55°C - 1 min. 72°C - 5 min. 72°C Amorces : 81F : TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC 691R : AAAAATTAAACGCTACTCCA 30x 35x 30x
Annexes
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