3.1. Culture virale et cellulaire
Les cellules LLC-MK2 ont été maintenues à 37°C, 5% CO2 dans du milieu essentiel minimal (MEM) (Life Technologies), supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF). La souche clinique hMPV-A C-85473 a été utilisée pour infecter des cellules LLC-MK2, confluentes à 95%, dans du milieu optiMEM (Life Technologies) supplémenté avec 0,0002% de trypsine (Sigma) jusqu’à l’apparition d’effets cytopathiques sur 75-90% de la surface cellulaire. Le virus a par la suite été récolté puis concentré par ultracentrifugation. Brièvement, les cellules infectées ont été grattées puis transférées avec le surnageant dans des contenants cryo-résistants afin de les congeler à -80°C. La suspension a ensuite été dégelée à température pièce puis conservée sur glace. Les débris cellulaires ont été éliminés par une centrifugation rapide à 2500 rpm, 10 minutes. Le surnageant, contenant le virus, a finalement été ultra-centrifugé pour « culoter » celui-ci. Les culots ont été resuspendus dans 6 ml de milieu optiMEM frais.
3.2. Microneutralisations
Les titres en anticorps neutralisants ont été déterminés par un test de microneutralisation en culture cellulaire. Les prélèvements sanguins ont été centrifugés à 3500 rpm pendant 15 minutes à 4°C pour séparer les sérums. Ces derniers ont été inactivés à 56°C pendant 30 minutes. Des dilutions sériées 1:2 de sérum inactivé à la chaleur ont été mélangées avec un volume équivalent de milieu d’infection contenant 25 unités formatrices de fluorescence (UFF) du virus rC-85473, exprimant la GFP. Après 90 minutes d’incubation à 37°C, le mélange sérum/virus a été transféré sur une plaque de 96-puits contenant des cellules LLC-MK2 prélavées avec du PBS. Les plaques ont ensuite été incubées à 37°C, 5% CO2. Quatre jours suivant l’infection, les cellules ont été fixées avec de la formaline 4% et observées sous microscopie à fluorescence pour l’apparition d’UFF. Les titres en anticorps neutralisants ont été déterminés selon la dilution la plus élevée où une absence d’UFF était notée.
3.3. Titres en anticorps totaux par ELISA
Les titres d’anticorps totaux ont été déterminés par l’utilisation d’un test ELISA indirect tel que décrit précédemment [202, 234]. Brièvement, le fond des puits de plaques 96-puits
(Immulon, Flat-bottom, 4HBX, High Flange-Fisher) a été recouvert avec4 log10 d’unités formatrices de plaques (UFP) de virus hMPV C-85473 inactivé à la formaline. Les puits ont été bloqués avec du PBS-0.1% Tween20 contenant 3% de sérum de chèvre (Life Technologies) avant l’ajout des sérums dilués en série 1:2. Les plaques ont ensuite été incubées pendant deux heures à température pièce, puis lavées trois fois avec du PBS- 0.1% Tween20. Cent µl par puits de Goat anti-mouse IgG (H&L) [HRP], dilué 1:2500, ont été ajoutés puis incubés une heure à température pièce, suivi de quatre lavages avec du PBS-0.1% Tween20. Sigma-Fast o-phenulenediamine dihydrochloride (Sigma OPD) a été utilisé comme substrat de révélation avant la lecture des absorbances à une longueur d’onde de 490nm. Les titres ont été déterminés selon la dernière dilution où l’absorbance était plus élevée que la valeur du contrôle négatif + trois déviations standards.
3.4. Titres viraux pulmonaires
Les titres viraux pulmonaires ont été déterminés par dilutions sériées d’homogénats de poumons sur cellules LLC-MK2. Les poumons ont été prélevés au jour 5 post-infection et congelés immédiatement dans l’azote liquide. Par la suite, les poumons ont été dégelés à température pièce puis homogénéisés dans du PBS-0.2 GVF, à l’aide d’un broyeur à tissus. Des dilutions sériées 1:10 dans du milieu d’infection supplémenté de 0.1% GVF ont été effectuées à partir de l’homogénat. Les dilutions ont été déposées sur des plaques 24- puits de cellules LLC-MK2 et incubées pendant 2 heures à 37°C, 5% CO2. Après avoir retiré le milieu, un « overlay » composé d’un ratio 1:1 optiMEM et méthylcellulose 1.6% a été ajouté. Suite à une incubation de 5 jours à 37°C, 5% CO2, les plaques ont été inactivées avec de la formaline 4% afin de procéder à l’immunocoloration. Le calcul des titres viraux a été déterminé à partir du décompte des unités formatrices de plaques (UFP) et rapporté en tant qu’UFP par ml.
3.5. Immunocoloration
L’immunocoloration des cellules infectées a été effectuée comme décrit précédemment [72]. Brièvement, des plaques de 24 puits contenant du virus fixé à la formaline ont été lavées avec du PBS avant d’être bloquées dans le PBS-5% lait pendant une heure à 37°C. Les plaques ont par la suite été incubées avec l’anticorps monoclonal anti-F hMPV 1017 (gracieuseté de MedImmune Inc., Gaithersburg, MD) pendant une heure à 37°C. Deux lavages avec du PBS ont été effectués avant une incubation d’une heure à 37°C
avec l’anticorps secondaire couplé à la HRP (HRP-Goat anti-hamster). La coloration des cellules a été réalisée avec le substrat TrueBlue (KPL) et l’observation des UFP a été faite à l’aide d’un microscope binoculaire.
3.6.
Immunobuvardage avec l’AcMo MF1
Des échantillons de protéines purifiées ont été séparés sur gels de polyacrylamide
Fastcast (Bio-Rad) et transférés sur des membranes de nitrocellulose 0.45 µm par transfert en milieu humide. Les membranes ont été bloquées toute la nuit à 4°C dans du PBS-BSA 5%. L’anticorps monoclonal MF1 dilué 1:100000 dans le PBS-BSA 5% a été appliqué sur les membranes pendant une heure à température pièce. Trois lavages avec du PBS-1%-0.1% Tween20 ont été effectués avant l’ajout de l’anticorps secondaire couplé à la HRP (HRP-Goat anti-mouse) dilué 1:2500 dans le PBS-BSA 5%. Les membranes ont été révélées par chemiluminescence et les images ont été prises avec le ChemiDoc (Bio- Rad).
3.7.
Immunobuvardage avec l’AcMo 1017
Des échantillons de protéines purifiées ont été séparés sur gels de polyacrylamide Fastcast (Bio-Rad) et transférés sur des membranes de nitrocellulose 0.45 µm par transfert en milieu humide. Les membranes ont été bloquées toute la nuit à 4°C dans du PBS-Lait 5%. L’anticorps monoclonal 1017 dilué 1:10000 dans le PBS-Lait 5% a été appliqué sur les membranes pendant une heure à température pièce. Trois lavages avec du PBS-Lait 5%-0.1% Tween20 ont été faits avant l’ajout de l’anticorps secondaire couplé à la HRP (HRP-rabbit anti-hamster) dilué 1:2500 dans le PBS-Lait 5%. Les membranes ont été révélées par chemiluminescence et les images ont été prises avec le ChemiDoc (Bio-Rad).
3.8. Immunisation des souris BALB/C
Des souris BALB/C âgées entre 4 et 6 semaines (Charles River Laboratories) ont été hébergées par groupe de quatre dans des cages de microisolation. Les souris ont été immunisées à deux reprises, à 14 jours d’intervalle, avec 30 µg de protéine purifiée. La voie d’immunisation intramusculaire (IM) a été sélectionnée pour notre étude. Cette voie est couramment utilisée en laboratoire et constitue une des voies d’immunisation chez les humains également. Trente µg de protéine purifiée ont été injectés afin d’immuniser les
souris avec un excès d’antigène afin de s’assurer que tous les animaux ont reçu suffisamment d’antigène. L’excès d’antigène permet également d’écarter les faibles variations observées lors des dosages protéiques puisque certains dosages comportent des écarts-types plus importants. Des groupes de 16 animaux ont été formés pour chacune des protéines testées. Toutes les protéines ont été évaluées en combinaison ou non avec l’adjuvant alum (Alhydrogel, Cederlane) dans un ratio 1:1. Des groupes contrôles négatifs, avec ou sans alum, ont été immunisés avec du surnageant de culture de cellules 293F, non transféctées, concentrées de manière similaire aux protéines F-hMPV. Le groupe contrôle adjuvanté a reçu une quantité d’alum équivalente à la quantité la plus élevée utilisée dans les préparations vaccinales. Des prélèvements sanguins ont été faits le jour avant chaque immunisation ainsi que 14 jours suite à la dernière immunisation. Deux semaines après la seconde immunisation, les souris ont été infectées avec 6.52 log10 TCID50 de la souche C-85473 hMPV dilué dans 25 µl de solution saline 0.9% stérile. Huit souris par groupe ont été surveillées quotidiennement pour l’apparition de symptômes comme la perte de poids, le poil ébouriffé et l’apparence générale. Au jour 5 post-infection, quatre animaux par groupe ont été sacrifiés et les poumons ont été prélevés pour évaluer les titres viraux et doser les cytokines. Quatre autres souris ont été euthanasiées et les poumons ont été fixés à la formaline pour des tests histopathologiques suite à une coloration hématoxyline/éosine. Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité de Protection Animal du Centre Hospitalier Universitaire de Québec en accord avec les directives de soins des animaux du Conseil Canadien.
3.9. Scores histopathologiques
Les poumons ont été prélevés au jour 5 post-infection et fixés avec de la formaline 4%. Les poumons fixés ont été incorporés dans de la paraffine, coupés en tranches de 5 µm, déposés sur lames et colorés avec de l’hématoxyline-éosine. Les lames ont été analysées par un pathologiste à l’aveugle. Une échelle semi-quantitative a été utilisée pour évaluer chaque paramètre de l’inflammation. L’inflammation bronchiale/endobronchiale, péribronchiale, périvasculaire, interstitielle, pleurale et intra-alvéolaire a été évaluée individuellement et un score inflammatoire total a également été calculé. L’échelle semi- quantitative s’étend de 0, où il y a absence d’inflammation, à 3, où une inflammation marquée est présente. Le type d’infiltration cellulaire a aussi été caractérisé comme aigu, chronique ou les deux.
3.10. Dosage des cytokines
Les cytokines IL-4 et IFNy ont été dosées par l’utilisation d’un kit « Bio-Plex Luminex » (Bio-Rad #Y600000K2Z) selon les instructions du manufacturier. Brièvement, des aliquots d’homogénats de poumons ont été mélangés à un cocktail d’inhibiteur de protéases puis congelés à -20°C. Les homogénats ont été dégelés à température pièce puis centrifugés à 2500 rpm, 4°C, pendant 10 minutes. Une plaque de 96-puits a été préparée avec les billes de détection selon les instructions du fournisseur. Cinquante µl, par puits, d’homogénats de poumons non-dilués ont été déposés. Après 30 minutes d’agitation à 850 rpm, les billes sont lavées puis des anticorps secondaires sont ajoutés. Suite à une incubation de 30 minutes à 850 rpm, de la streptavidine est ajoutée comme substrat pour la révélation. La plaque de 96-puits est lue par un appareil Bio-Plex 200 (Bio-Rad) puis les résultats sont analysés et compilés. Le dosage des échantillons se fait à partir des courbes standards et la concentration est calculée en pg/ml.
3.11. Génération des protéines F pré et post-fusion
Toutes les protéines ont été générées par mutagenèse dirigée. Les codons du gène de la protéine sauvage, dont la région transmembranaire a été enlevée et un HisTag ajouté, ont été optimisés pour les codons humains et le gène cloné dans le vecteur pcDNA3.1+. Six paires d’amorces différentes ont été utilisées afin de générer six protéines par mutagenèse dirigée (tableau 3). Les mutations ciblées seront discutées davantage à la page 50. Des conditions PCR standards ont été utilisées suivies par une transformation dans des bactéries compétentes XL10. La purification de l’ADN s’est faite à l’aide du kit GeneElute plasmid miniprep (Sigma) et un séquençage a été effectué pour confirmer l’incorporation des mutations désirées. Des cellules en suspension 293F (Fisher) ont été transfectées pour la production protéique selon les instructions du fournisseur. Les cellules provenant d’un litre de culture cellulaire, concentrée à 3x106 cellules par millilitre, ont été transfectées avec 1.25 mg d’ADN purifié. Cinq jours plus tard, les cellules ont été éliminées par centrifugation et le surnageant congeler à -20°C jusqu’à la purification. Des billes de NI-NTA (Qiagen) ont été utilisées pour la concentration des protéines. Cinquante millilitres de billes ont été lavés à deux reprises avec 200 ml de tampon de liaison (500mM NaCl, 20mM NaH2PO4, 30mM imidazole) et ajoutés à 1L de surnageant de culture dégelé à température pièce. Vingt pour cent de glycérol et 50 ml de tampon d’échantillon 10x (5000mM NaCl, 200mM NaH2PO4, 300mM imidazole) ont été ajoutés au mélange avant
une incubation à 4°C, sous agitation toute la nuit. Le mélange a été chargé sur cinq colonnes de chromatographie et 200 ml par colonne, a été laissé éluer. Les colonnes ont été lavées deux fois avec 200 ml de tampon de liaison avant l’ajout du tampon d’élution (500mM NaCl, 20mM NaH2PO4, 250mM imidazole). Après une incubation de 15 minutes, les éluats ont été récupérés. L’étape d’élution a été répétée deux fois. Les éluats ont été regroupés dans un bécher et ont été dialysés contre 4L de PBS deux fois avant une concentration finale sur colonnes AMICON ULTRA-15ML 3K NMW (Fisher). Quinze millilitres d’éluat, par colonne, ont été centrifugés à 3500 rpm jusqu’à un volume final de 500 µl. Le dosage des protéines a été fait par la technique de Bradford.
Tableau 3. Oligonucléotides pour mutagenèse dirigée
MUTATIONS
Détails en acides
nucléiques
Sauvage Mutant Amorce sens Amorce anti-sens
T160N T : ACC N : AAC 5' - AGAGTGCTTGCCAACGCTGTGCGGGAG - 3' 5' - CTCCCGCACAGCGTTGGCAAGCACTCT - 3'
A161N A : GCT K : AAC 5' - GAGTGCTTGCCACCAACGTGCGGGAGCTGGA - 3' 5' - TCCAGCTCCCGCACGTTGGTGGCAAGCACTC - 3'
A185P A : GCC P : CCT 5' - TAAGTGTGATATTCCTGACCTCAAGATGGC - 3' 5' - GCCATCTTGAGGTCAGGAATATCACACTTA - 3'
D454H D : GAC H : CAT 5' - GTCAAATTTCCCGAGCATCAGTTTAATGTGGCA - 3' 5' - TGCCACATTAAACTGATGCTCGGGAAATTTGAC - 3'
F456W F : TTT W :
TGG 5' - TCCCGAGCATCAGTGGAATGTGGCACTTGACC - 3' 5' - GGTCAAGTGCCACATTCCACTGATGCTCGGGA - 3' N457H N : AAT H : CAC 5' - CCGAGCATCAGTGGCACGTGGCACTTGACCA - 3' 5' - TGGTCAAGTGCCACGTGCCACTGATGCTCGG - 3'
A125C A : GCA C : TGC 5' - CGGGGTGGCTATATGCAAGACGATCAGACTG - 3' 5' - CAGTCTGATCGTCTTGCATATAGCCACCCCG - 3'
I260C I : ATC C : TGC 5' - GTTCGGCATTCTGTGCGGGGTATACGGATC - 3' 5' - GATCCGTATACCCCGCACAGAATGCCGAAC - 3'
T127C T : ACG C : TGC 5' - GTGGCTATAGCAAAGTGCATCAGACTGGAGTC - 3' 5' - GACTCCAGTCTGATGCACTTTGCTATAGCCAC - 3'
3.12. Analyses statistiques
Le logiciel Prism 5 (GraphPad) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques. Un One- way ANOVA avec le post-test de Dunnett a été effectué pour comparer les différents groupes. Les groupes adjuvantés ont été comparés avec le groupe Mock adjuvanté. Similairement, les groupes non-adjuvantés ont été comparés au groupe Mock non- adjuvanté.