Identification de la forme pré-fusion ou post-fusion

L’analyse comparative des séquences primaires et structurales de la protéine F-VRS stabilisée en forme pré-fusion avec celles de la protéine F-hMPV a permis de cibler six mutations différentes pour la stabilisation de sa structure. Les régions mutées sont

identiques ou équivalentes à celles qui ont permis la stabilisation de la protéine F-VRS. Les mutants T160N et A161N ont pour but de remplir la cavité protéique présente chez la forme pré-fusion afin d’empêcher son élongation vers la forme post-fusion. Le mutant A185P est une mutation potentiellement hautement stabilisante alors que la mutation 454- HQWH-457 diminue l’accumulation de charges négatives sur la surface de la protéine en pré-fusion. La stabilisation par la création de ponts disulfure a également été exploitée par les mutants A125C/I260C et T127C/I260C. Ces deux derniers ainsi que les mutants T160N et A161N ciblent une même région. Puisque les analyses des séquences et structures ont révélé que l’un ou l’autre de ces mutants pourrait conférer la stabilisation désirée, les deux variations de la mutation ont été testées afin de s’assurer d’obtenir le résultat escompté. La forme des différents mutants de la protéine F du hMPV a été révélée à l’aide de deux techniques. L’immunobuvardage avec l’anticorps monoclonal MF1, spécifique à la forme post-fusion et l’anticorps monoclonal 1017, réagissant avec les deux formes de la protéine, ou à l’aide de test ELISA type sandwich avec ces mêmes anticorps. Les essais en immunobuvardage ont été effectués avec deux anticorps de révélation : le MF1 qui est spécifique à la forme post-fusion [19, 179, 226] ainsi que l’anticorps monoclonal 1017 (MedImmune) qui réagit avec les deux formes [4]. Les signaux obtenus sont comparés de manière à vérifier si l’on observe une diminution de signal lorsqu’on utilise l’anticorps spécifique à la forme post-fusion en comparaison avec le signal de base établi par le marquage avec l’anticorps non-spécifique aux conformations protéiques, ce qui indiquerait une possibilité que la protéine soit en forme pré-fusion. Une telle diminution est observable par immunobuvardage pour deux des protéines, soit l’A125C/I260C et T127C/I260C (figure 14b). Pour le mutant 454-HQWH-457, le signal obtenu avec cet anticorps semble faible; toutefois, le mutant 454-HQWH-457 n’est pas marqué par l’anticorps 1017. Cette absence de marquage pourrait être due à la mutation de l’épitope ou la modification conformationnelle du site de liaison de l’anticorps. Une vérification de l’expression protéique par coloration au bleu de Coomassie a été effectuée et la protéine apparaît (figure 13). Le faible signal obtenu pourrait alors être dû à une conformation majoritairement en pré-fusion. Les essais par ELISA de type sandwich, dont l’analyse est basée sur les mêmes hypothèses, offrent des résultats similaires à l’exception des mutants A185P, T160N et A161N qui sont moins marqués par l’anticorps post-fusion MF1, soit 49, 54 et 11% de signal en comparaison à 113, 122 et 70% avec l’anticorps 1017 (figure 15).

L’immunobuvardage étant une technique qui nécessite de chauffer les échantillons protéiques, plusieurs éléments doivent être considérés. Premièrement, certaines études ont montré que la chaleur induit le changement de la protéine F pour générer une forme post-fusion. Cependant, plusieurs essais avec des anticorps monoclonaux montrent que les résultats suite à des essais avec et sans traitement à la chaleur peuvent demeurer les mêmes [232, 283]. Des essais d’affinité avec l’anticorps MF1 spécifique au motif 6HB de la forme post-fusion ont montré qu’aucune différence de liaison et de marquage n’est induite suite à un traitement thermique à 100°C [179, 232, 283]. Il est à noter que ces résultats sont davantage vrais chez les protéines clivées. La diminution de signal, pour les protéines A125C/I260C et T127C/I260C, serait possiblement due à la prédominance de la forme pré-fusion de ces protéines (figure 14b). Par ailleurs, les essais en ELISA de type sandwich, où les protéines sont sous forme native et non chauffée, offrent des résultats similaires. Les mutants pour lesquels des résultats différents sont obtenus sont le T160N, A161N et A185P (figures 14b et 15). Cependant, il s’agit d’un test moins spécifique que l’immunobuvardage, ce qui expliquerait, en partie, la différence observée. Dans les tests d’immunobuvardage, même une faible proportion de protéine post-fusion est fortement marquée alors que chez un ELISA sandwich, la quantité de protéine liée doit être plus grande afin d’observer une différence notable au niveau du signal. La proportion de protéine post-fusion au sein de ces trois protéines, T160N, A161N et A185P, pourrait donc être faible. Une seconde hypothèse serait que la mutation induite chez ces protéines empêche la liaison de l’anticorps lorsque la protéine est dans sa forme native. L’épitope serait caché ou son site de liaison bloqué par les modifications de la structure apportées par les mutations T160N, A161 et A185P. Une équipe de recherche a par ailleurs récemment publié un article avec une protéine très similaire, portant la mutation A185P, stabilisée en forme pré-fusion [19]. Dans cette étude, des mutants de la protéine F-hMPV, ciblés par des analyses comparatives avec la structure 3D de la protéine F-VRS stabilisée en forme pré-fusion, ont été produits. Parmi les protéines mutées, un mutant A185P a été défini sous forme pré-fusion. Des tests ELISA ainsi que de résonance plasmonique avec des anticorps spécifiques à la forme pré-fusion ou post-fusion ont été effectués pour analyser la conformation des protéines. Les essais ELISA faits dans cette étude montrent une tendance similaire à nos résultats pour le mutant A185P. La cristallisation de leur protéine a confirmé ces résultats qui montrent que leur mutant A185P est stabilisé dans une forme pré-fusion [19, 179]. Les résultats obtenus, par immunobuvardage et ELISA, indiquent la présence de protéine pré-fusion chez tous les mutants générés. Cependant,

seuls les mutants A125C/I260C et T127C/I260C présentent des résultats qui corrèlent avec une majorité de la forme pré-fusion. Le mutant 454-HQWH-457, qui réagit très faiblement avec l’AcMo MF1, pourrait également être majoritairement en forme pré-fusion, mais un marquage par un anticorps réagissant avec les deux formes de la protéine est nécessaire. Pour les protéines T160N, A161N et A185P, les essais indiquent un mélange des formes protéiques avec des taux non négligeables de forme post-fusion.

L’absence d’anticorps monoclonal réagissant avec la forme pré-fusion limite notre capacité d’analyse des protéines. Un tel anticorps permettrait de valider les résultats d’ELISA ainsi que ceux de l’immunobuvardage et serait un atout pour la suite des expériences. Une étude récente analysant la capacité d’un AcMo spécifique à la forme pré-fusion (MPE8) offre une possibilité d’analyser davantage les protéines mutées [179]. Ce type d’essai, ainsi que la cristallographie et la cryo-électromicroscopie sont de futures analyses à considérer pour révéler davantage la structure des protéines générées.