Développement de vaccins sous-unitaires contre le
métapneumovirus humain
Mémoire
Martin Pilaev
Maîtrise en microbiologie-immunologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Développement de vaccins sous-unitaires contre le
métapneumovirus humain
Mémoire
Martin Pilaev
Sous la direction de :
Résumé
Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus qui circule dans la population humaine depuis plus de 70 ans et a été isolé pour la première fois en 2001. Il est la troisième cause mondiale en lien avec les hospitalisations d’enfants pour maladies aigües des voies respiratoires supérieures et inférieures. Il est responsable d’une multitude de complications chez les jeunes enfants, les personnes âgées ainsi que les personnes immunosupprimées. À ce jour, il n’existe aucun vaccin commercial contre le hMPV. Dans les récentes années, la protéine de fusion F, qui est le principal antigène viral, a fait l’objet d’une multitude d’essais principalement pré-cliniques en vaccination. La découverte que, chez le virus respiratoire syncytial (VRS), la protéine F stabilisée en forme pré-fusion est plus immunogène a fourni de nouvelles pistes pour le développement vaccinal. Pour ces raisons, l’objectif de ma maîtrise est le développement d’un vaccin sous-unitaire à base de protéine F-hMPV stabilisée en pré-fusion et son test chez le modèle de la souris BALB/C pour vérifier son potentiel protecteur. Nos études ont démontré qu’il n’y a pas de différence significative, en termes d’immunogénicité, entre la forme pré- et post-fusion de la protéine F chez le hMPV. Les essais d’immunogénicité ont également démontré la nécessité de l’ajout de l’adjuvant alum pour élucider une réponse immunitaire chez la souris BALB/C. Les immunisations par les protéines adjuvantées ont démontré le développement d’anticorps neutralisants. Suite à l’infection, la réplication virale pulmonaire a été diminuée sous le seuil de détection des techniques utilisées, mais l’inflammation pulmonaire a persisté. Les vaccins adjuvantés n’ont pas influencé la perte de poids chez la souris, mais ont amélioré les autres symptômes cliniques tels l’activité physique et le poil ébouriffé. Les vaccins F-hMPV sans alum présentent certaines caractéristiques de réponse immune exagérée (titres en anticorps neutralisants nuls; état physique détérioré) et devront être analysés davantage. Les vaccins F-hMPV avec alum n’ont pas démontré des signes de réponse immune exagérée, suite à l’infection par le hMPV, malgré une réponse immune de type Th2 plus forte. Globalement, malgré une réduction des titres viraux à un seuil indétectable, aucun des vaccins n’a protégé complètement le modèle murin contre l’infection par le hMPV. Les vaccins développés au cours de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies d’immunisation, de nouveaux essais de vaccination en combinaison avec d’autres adjuvants et peuvent servir de base pour le développement d’un vaccin efficace contre le hMPV.
Abstract
The human metapneumovirus has been first isolated in 2001 despite its circulation in the human population for more than 70 years. HMPV is the third leading cause of children hospitalisations associated with acute respiratory tract infections. Complications occur commonly in young children, the elderly and the immunocompromised. To this day, no vaccine has been licensed for use against hMPV. In recent years, the F protein, considered the most immunodominant antigen, has been the target of many pre-clinical vaccine trials. The discovery, for RSV, that a prefusion bound F protein is more immunogenic than post-fusion has encouraged new vaccination approaches. Based on this discovery, the aim of this project is the development of a prefusion bound F-hMPV subunit vaccine and testing its potency to protect the BALB/C model. Following challenge, no significant difference between potentially prefusion bound proteins and wild type protein was observed. Immunisation trials revealed the necessity of adding an adjuvant, alum in this case, to elicit an immune response in mice. Neutralizing antibodies were observed with F-hMPV vaccines containing the alum adjuvant. Post-immunisation challenge trials revealed reduction of lung viral replication below detection levels and persisting inflammation. Weight loss was not affected by vaccination, but animals immunised with adjuvanted F-hMPV proteins exhibited better physical condition and no signs of disease such as diminished activity and ruffed fur. F-hMPV vaccines without alum exhibited some characteristics of enhanced disease (no neutralizing antibodies; affected physical condition) and require further analysis. Enhanced disease was not observed in the F-hMPV adjuvanted groups despite higher Th2/Th1 ratios with adjuvanted proteins. None of the vaccines tested were able to fully protect the mouse model upon challenge. Vaccines developed in this study will be useful in future trials and could be tested with other adjuvants or vaccination strategies.
Table des matières
Résumé ... 2
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des tableaux ... viii
Liste des figures ... ix
Liste des abréviations : ... x
Remerciements ... xi Introduction générale ... 1 1.1. Découverte du hMPV ... 1 1.2. Généralités du virion hMPV ... 1 1.2.1. Classification virale ... 1 1.2.2. Morphologie du virion ... 2 1.2.3. Génome viral ... 4
1.3. Protéines encodées par le hMPV ... 5
1.3.1 Protéines de surface ... 5
1.3.2. Protéine matrice M ... 9
1.3.3. Protéines du complexe de réplication (N, L et P) ... 10
1.3.4. Protéine M2-2 ... 11
1.4. Cycle de réplication virale : ... 11
1.4.1. Attachement ... 12
1.4.2. Fusion ... 13
1.4.3. Transcription virale : ... 14
1.4.4. Réplication du génome ... 15
1.4.5. Assemblage des particules virales ... 16
1.5. Épidémiologie ... 16
1.6. Manifestations cliniques ... 18
1.6.1. Infection et populations à risque ... 18
1.6.2. Co-infections ... 18
1.6.3. Syndromes cliniques ... 19
1.6.4. Pathologie et complications liées à l’infection par le hMPV ... 19
1.7. Réponse immunitaire... 22 1.8. Changements histopathologiques ... 23 1.9. Diagnostic et détection du hMPV ... 24 1.9.1. Diagnostic moléculaire ... 24 1.9.2. Culture cellulaire ... 25 1.10. Modalités thérapeutiques ... 26 1.10.1. Généralités ... 26
1.10.2. Antiviraux ... 26
1.10.3. Les small interfering RNAs (siRNA) ... 28
1.10.4. Les immunoglobulines intraveineuses ... 28
1.10.5. Les anticorps monoclonaux ... 29
1.11. Modalités prophylactiques ... 30
1.11.1. Vaccins avec des virus inactivés ... 30
1.11.2. Vaccins vivants atténués ... 31
1.11.3. Vaccin à ADN ... 33
1.11.4. Vaccins sous-unitaires... 34
1.11.5. Les particules pseudo-virales (PPV) ... 35
1.12. Les adjuvants ... 36
1.13. Modèles animaux ... 38
1.13.1. Souris BALB/C ... 38
1.13.2. Rat des cotonniers ... 39
1.13.3. Les hamsters et les furets ... 39
1.13.4. Les primates non-humains ... 40
Chapitre 2. Hypothèses et objectifs ... 41
2.1. Hypothèse ... 41
2.2. Objectifs ... 42
Chapitre 3. Méthodologie ... 44
3.1. Culture virale et cellulaire ... 44
3.2. Microneutralisations... 44
3.3. Titres en anticorps totaux par ELISA... 44
3.4. Titres viraux pulmonaires ... 45
3.5. Immunocoloration ... 45
3.6. Immunobuvardage avec l’AcMo MF1 ... 46
3.7. Immunobuvardage avec l’AcMo 1017 ... 46
3.8. Immunisation des souris BALB/C ... 46
3.9. Scores histopathologiques ... 47
3.10. Dosage des cytokines ... 48
3.11. Génération des protéines F pré et post-fusion ... 48
3.12. Analyses statistiques ... 49
Chapitre 4. Résultats ... 50
4.1. Génération et production des mutants F-hMPV. ... 50
4.2. Vérification de l’expression des protéines par coloration au bleu de Coomassie ... 51
4.3. Identification de la forme pré- ou post-fusion par immunobuvardage ... 51
4.4. Identification des protéines par ELISA de type sandwich ... 52
4.5. Développement d’anticorps totaux et neutralisants chez la souris BALB/C ... 53
4.7. Mortalité chez les souris BALB/C infectées suite à l’immunisation ... 56
4.8. Réplication virale pulmonaire chez la souris BALB/C ... 57
4.9. Histopathologie pulmonaire ... 58
4.10. Dosage des cytokines. ... 59
Chapitre 5. Discussion ... 61
5.1. Identification de la forme pré-fusion ou post-fusion ... 62
5.2. Immunogénicité des différents vaccins F-hMPV ... 65
5.3. Choix du modèle animal et évolution des symptômes cliniques ... 66
5.4. Réplication virale ... 68
5.5. Histopathologie ... 69
5.6. Caractérisation de la réponse immunitaire ... 71
5.7. Réponse immune exagérée ... 73
Conclusion et perspectives ... 76
Liste des tableaux
TABLEAU 1. LES CARACTÉRISTIQUES DU VACCIN IDÉAL (ADAPTÉ DE [101]). ... 30 TABLEAU 2 : TABLEAU RÉCAPITULATIF DES AVANTAGES ET DÉSAVANTAGES DES DIFFÉRENTS TYPES DE
VACCINS ... 36 TABLEAU 3. OLIGONUCLÉOTIDES POUR MUTAGENÈSE DIRIGÉE ... 49
Liste des figures
FIGURE 1. CLASSIFICATION DES VIRUS DE LA FAMILLE DES PNEUMOVIRIDAE. ... 1
FIGURE 2. REPRÉSENTATION DU VIRION HMPV. ... 3
FIGURE 3. PARTICULES VIRALES OBSERVÉES PAR MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE. ... 3
FIGURE 4. ORGANISATION GÉNOMIQUE DU HMPV ET DU VRS. ... 4
FIGURE 5. MODÉLISATION 3D DES FORMES PRÉ-FUSION ET POST-FUSION DES PROTÉINES DE FUSION DU HMPV ET DU VRS. ... 6
FIGURE 6. SITES ANTIGÉNIQUES RETROUVÉS SUR LES DIFFÉRENTES FORMES DE LA PROTÉINE F DU VRS ET SITES ANTIGÉNIQUES CORRESPONDANTS CHEZ LE HMPV. ... 7
FIGURE 7. CYCLE DE RÉPLICATION DU HMPV. ... 12
FIGURE 8. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DE LA PROTÉINE DE FUSION F DU HMPV. ... 13
FIGURE 9. MÉCANISME DE FUSION VIRALE. ... 14
FIGURE 10. DISTRIBUTION SAISONNIÈRE DE QUATRE VIRUS RESPIRATOIRES (ADAPTÉ DE [136]). ... 17
FIGURE 11. DISTRIBUTION GÉOGRAPHIQUE DU HMPV. ... 17
FIGURE 12. EFFETS CYTOPATHIQUES OBSERVES SUITE À UNE INFECTION HMPV IN VITRO. ... 25
FIGURE 13. VÉRIFICATION DE L’EXPRESSION DES PROTÉINES SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE COLORÉ AU BLEU DE COOMASSIE. ... 51
FIGURE 14. IDENTIFICATION DE LA FORME PRÉ- OU POST-FUSION PAR IMMUNOBUVARDAGE. ... 52
FIGURE 15. ANALYSE DES FORMES DE LA PROTÉINE F PAR ELISA DE TYPE SANDWICH. ... 53
FIGURE 16. TITRES EN ANTICORPS DÉVELOPPÉS SUITE À L’IMMUNISATION DES SOURIS BALB/C AVEC DES VACCINS SOUS-UNITAIRES À BASE DE PROTÉINE F-HMPV, COMBINÉS OU NON À L’ADJUVANT ALUM. 54 FIGURE 17. PERTES DE POIDS OBSERVÉES SUITE À L’INFECTION DES SOURIS BALB/C. ... 56
FIGURE 18. COURBES DE SURVIE CHEZ DES SOURIS BALB/C SUITE À UNE INFECTION AVEC 6.52 LOG10 TCID50 DE VIRUS HMPV C-85473. ... 57
FIGURE 19. TITRES VIRAUX PULMONAIRES OBTENUS PAR CULTURE IN VITRO SUR CELLULES LLC-MK2, SUITE À UNE INFECTION AVEC 6.52 LOG10 TCID50 DE VIRUS HMPV C-85473 CHEZ DES SOURIS BALB/C IMMUNISÉES. ... 58
FIGURE 20. SCORES HISTOPATHOLOGIQUES. ... 59
FIGURE 21. DOSAGE DES CYTOKINES IL-4 ET IFNY POST-INFECTION HMPV CHEZ DES SOURIS BALB/C IMMUNISÉES AVEC DES VACCINS À BASE DE PROTÉINE F-HMPV. ... 60
Liste des abréviations :
AcMo Anticorps monoclonal ADN Acide déoxyribonucléique AMPV Métapneumovirus aviaire ARN Acide ribonucléiqueARNm Acide ribonucléique messager hMPV Métapneumovirus humain
CPA Cellules présentatrices d’antigènes GaG Glycosaminoglycanes
HRA Terme anglais : Heptad repeat A HRB Terme anglais : Heptad repeat B Ig Immunoglobulines
IL Interleukine INF Interféron
MEM Milieu essentiel minimal µm Micromètre
mM Millimolaire
MPOC Maladie pulmonaire obstructive chronique
Ni-NTA Terme anglais : Nickel-nitrilotriacetic acid agarose
PBS Terme anglais : Phosphate buffered salin (tampon phosphate-saline) PCR Terme anglais : Polymerase Chain Reaction
PPV Particule pseudo-virale
SIDA Syndrome de l’immunodéficience acquise siRNA Terme anglais : Small-interfering RNA SRAS Syndrome respiratoire aigu sévère SVF Sérum de veau fœtal
TCID50 Terme anglais : Tissue culture infectious dose 50 % Th1 Terme anglais : T-Helper cell type 1
Th2 Terme anglais : T-Helper cell type 2 TLR Terme anglais : Toll-like receptor UFF Unité formatrice de fluorescence UFP Unité formatrice de plaques
VIH Virus de l’immunodéficience humaine VRS Virus respiratoire syncytial
Remerciements
Mener à terme mes études de maîtrise n’aurait pas été possible sans l’aide et l’appui de plusieurs personnes que je tiens à mentionner.
Tout d’abord, je tiens à remercier mon directeur de recherche le Dr Guy Boivin de m’avoir offert la possibilité de travailler sur un projet multidisciplinaire très intéressant au sein de son laboratoire. Sa rigueur, son expertise, son travail assidu ainsi que sa passion pour la science en font un directeur très stimulant qui nous permet de nous dépasser.
Je tiens également à remercier Marie-Ève Hamelin qui a été d’une aide précieuse et au cœur de la progression de mon projet. Son expertise, sa pédagogie exceptionnelle et sa grande disponibilité m’ont permis de progresser plus aisément dans mes recherches.
Je ne pourrais oublier de souligner le travail acharné de Julie Carbonneau sans qui mes journées n’auraient pas été aussi simples. Son aide inconditionnelle et sa grande gentillesse ne peuvent être passées sous silence.
J'aimerais aussi exprimer un merci à tous mes autres collègues de travail Nathalie Goyette, Karima Zarrouk, Marie-Hélène Cavanagh, Yacine Abed, Marie-Christine Venable, Chantale Rhéaume, Clément Fage, Mariana Baz, Olus Uyar, Liva Checkmahomed, Zeineb Mhamdi, Coraline Canivet, Jocelyne Piret et William Enlow avec qui j’ai pu partager des moments enrichissants tant au niveau personnel que scientifique.
Finalement, je tiens à remercier toutes les personnes qui m’ont soutenu
Introduction générale
1.1. Découverte du hMPV
Le métapneumovirus humain (hMPV) a été identifié pour la première fois en 2001 dans les Pays-Bas. Il a été isolé à partir d’aspirations nasopharyngées chez 28 jeunes patients (< 5 ans) présentant des infections aiguës des voies respiratoires. Tous les échantillons ont été récoltés durant la saison hivernale et ne présentaient aucun pathogène connu. L’identification de ce pathogène et sa caractérisation en Amérique du Nord ont été effectuées par l’équipe du Dr Boivin quelques mois plus tard [210, 272]. Plusieurs autres équipes ont identifié le pathogène par la suite et il est aujourd’hui retrouvé à l’échelle mondiale. Des études épidémiologiques ont révélé la circulation du pathogène depuis plus de 70 ans [241].
1.2. Généralités du virion hMPV
1.2.1. Classification virale
Le hMPV est un virus de la famille des Pneumoviridae, anciennement une sous-famille de la famille de Paramyxoviridae, qui fait partie de l’ordre des Mononegavirales. Le genre
Orthopneumovirus est composé du virus respiratoire syncytial humain (VRS) ainsi que ses
équivalents chez les animaux. Le genre Metapneumovirus est composé du hMPV et du metapneumovirus aviaire (AMPV) [95, 225].
Figure 1. Classification des virus de la famille des Pneumoviridae.
HRSV, virus respiratoire syncytial humain; BRSV, virus respiratoire syncytial bovin; MRSV, virus respiratoire syncytial murin; HMPV, métapneumovirus humain; AMPV, métapneumovirus aviaire.
Les analyses génomiques classent les souches virales de hMPV dans deux génotypes, A et B [206], basés sur les homologies de séquence des gènes SH et G. Des études génotypiques révèlent que les gènes N, P, M, F, et L sont hautement conservés alors que les gènes G et SH sont variables [28]. Les groupes A et B sont divisés en deux sous-groupes soit A1, A2, B1 et B2. Au sein du sous-groupe A2, on retrouve une sous-division, A2a et A2b [287]. Bien qu’il y ait une différence génétique entre les groupes, pour le moment, il est impossible d’affirmer s’il s’agit de deux groupes antigéniquement différents. Des études chez les hamsters ont montré qu’il y a protection croisée entre des groupes hétérologues [123]. Des hamsters immunisés contre un virus de groupe A étaient protégés contre le groupe B. Les sérums neutralisent les deux groupes viraux, toutefois avec un taux 16 fois plus faible contre le virus hétérologue [123]. Des résultats similaires ont été observés chez des macaques in vivo [171, 274]. Des tests in vitro utilisant des sérums humains ont montré des résultats plus variables. Notamment, un individu séropositif pour le groupe A2 neutralisait du virus B2, mais pas une souche B1 [182]. Cette contradiction des études montre qu’il n’y a pas suffisamment de preuves pour déterminer s’il existe des
groupes antigéniques distincts au sein des virus hMPV.
Finalement, certaines souches virales classifiables dans le groupe A, mais qui ne correspondent à aucun des sous-groupes A1et A2, ont été identifiées. Ces souches pourraient évoluer pour former un troisième sous-groupe [32].
1.2.2. Morphologie du virion
Le virion du hMPV est représentatif de la famille des pneumoviridae. Similairement au VRS, les particules virales visualisées par microscopie électronique sont des sphères pléomorphiques ou sous forme filamenteuse [210, 272].Le diamètre des particules peut varier de 150 à 600 nm avec de courtes projections de l’enveloppe d’une taille moyenne de 15 nm [206]. Les particules sont composées d’une enveloppe lipidique dérivée de la membrane hôte acquise lors de la sortie du virus qui est tapissée d’une protéine matrice du côté interne et de protéines glycosylées du côté externe. À l’intérieur se retrouve la nucléocapside contenant le génome viral [95].
Figure 2. Représentation du virion hMPV.
Les protéines de surface ainsi que la protéine matrice sont présentées seules, les protéines N, P, L et le génome représentent la forme filamenteuse centrale. Les protéines M2-1 et M2-2 ne sont pas montrés (adapté de [94]).
La nucléocapside est aussi variable en dimensions que la particule virale, soit 17 nm de diamètre avec une longueur allant de 200 à 1000 nm [210].
Figure 3. Particules virales observées par microscopie électronique.
L’image présente cinq particules virales pléomorphes ainsi que la nucléocapside virale au coin supérieur de l’image. Une particule filamenteuse est aussi présentée dans le coin inférieur (adapté de [210]).
1.2.3. Génome viral
Le hMPV est un virus à ARN simple brin négatif d’une taille moyenne de 13,2 kb, environ 2 kb de moins que le génome du VRS. Il s’agit d’un génome non segmenté qui code pour un total de 8 gènes viraux qui produiront 9 protéines virales [206]. Le VRS, quant à lui, code pour 10 gènes et 11 protéines, ce qui explique la différence de taille du génome. Le génome du hMPV est protégé par la nucléocapside qui le recouvre en tout temps, même lors de la synthèse de nouveaux génomes. L’organisation génomique du virus débute par le gène N, suivi des gènes P, M, F, M2, SH, G et finalement L (figure 4). Cette organisation est commune pour les différentes espèces de métapneumovirus. En ce qui concerne les orthopneumovirus, tel le VRS, l’ordre génomique est modifié légèrement, en débutant par les gènes NS1, NS2 (codant pour les protéines non structurales), puis les gènes N, P, M, SH, G, F, M2, et L (figure 4).
Figure 4. Organisation génomique du hMPV et du VRS.
La figure présente l’ordre des différents gènes du métapneumovirus ainsi que ceux du virus respiratoire syncytial (tiré de [206]).
Chaque gène code pour une seule protéine, à l’exception du gène M2 qui code pour les protéines M2-1 et M2-2 [105]. Le gène M2 contient deux cadres de lecture ouverte (CLO) et le début du second chevauche la fin du premier de quelques nucléotides [105]. Chez le hMPV, tous les gènes sont séparés par de courtes régions intergéniques, alors que chez VRS les gènes M2 et L se chevauchent.
1.3. Protéines encodées par le hMPV
1.3.1 Protéines de surface
1.3.1.1. Protéine de fusion F
La protéine de fusion F est la protéine la plus conservée dans la famille des
pneumoviridae. Entre les groupes A et B chez le VRS on observe des séquences de la
protéine F identiques à 89% pour la séquence en acides aminés et à 81% pour la séquence nucléotidique. Pour le hMPV, les pourcentages d’homologie sont parmi les plus élevés, soit 98 et 94%, respectivement, entre CAN97-83 (groupe A)/CAN98-75 (groupe B)[132].
Tous les membres de la famille des pneumoviridae possèdent des protéines de fusion classe I qui, par leurs domaines structuraux conservés, semblent utiliser un mécanisme grossièrement semblable [151]1. La protéine F est présente chez le virus sous la forme d’un précurseur métaboliquement inactif appelé F0 [179, 243]. Dans sa forme inactive, le précurseur s’assemble pour former des homotrimères. Le précurseur est activé suite au clivage par des endoprotéases de la famille des furines dans le complexe trans-Golgi. Le clivage de la F0 génère deux produits (F1 et F2) liés par un pont disulfure. Chez le VRS, le site de clivage comprend un motif (Arg-X-Arg/Lys-Arg), correspondant au site de clivage préférentiel de la furine. Dans le cas du hMPV, le motif est plutôt composé de résidus Arg-Gln-Ser-Arg [27], ne correspondant pas au site de clivage consensus de la furine. En raison de cette différence de site de clivage, les souches cliniques de hMPV nécessitent souvent l’ajout de trypsine pour la culture in vitro des virus. Des études ont démontré qu’il ne s’agit toutefois pas d’un facteur limitant pour la pathogenèse, puisque des souches adaptées à la culture in vitro en absence de trypsine ne présentent pas d’augmentation de la réplication virale in vivo [27, 238].
Le clivage du précurseur est important pour la pathogenèse puisqu’il permet d’exposer le peptide de fusion. Lors de l’infection, le peptide de fusion, via son domaine hydrophobe, s’insère dans la membrane de la cellule hôte. La sous-unité F1 contient les Heptad repeats HRA et HRB ainsi que la région transmembranaire et la queue cytoplasmique. Ces deux dernières sont les points d’ancrage de la protéine F à la membrane virale. Les HRA et HRB, composés de sept acides aminés répétés dont cinq sont chargés et deux sont
hydrophobes, sont impliqués dans le processus de fusion via leur interaction mutuelle qui permet le rapprochement membranaire (voir chapitre mécanisme de fusion)[49, 55, 299]. Suite au processus de fusion, la protéine F est sous forme stable post-fusion (figure 5).
.
Figure 5. Modélisation 3D des formes pré-fusion et post-fusion des protéines de fusion du hMPV et du VRS.
(a) Structure 3D de la protéine F-hMPV sauvage ainsi que ses différents domaines. (b) Structure 3D de la protéine F-VRS sauvage ainsi que ses différents domaines. Le domaine C-terminal est présenté en rouge et le domaine N-terminal en bleu (adapté de [19, 186, 188]).
Ce changement de conformation est commun à tous les Pneumoviridae. Des études du VRS ont montré la présence d’un site antigénique supplémentaire qui est présent uniquement sur la forme pré-fusion [186] (figure 6).
Dans cette étude, il a été démontré qu’une protéine stabilisée en pré-fusion serait plus immunogène que la forme post-fusion [186].Le site identifié ø, présent uniquement en pré-fusion, serait à l’origine de cette réponse. Un anticorps humain, le MPE8, présentant un haut potentiel de neutralisation croisée contre VRS et hMPV, fut identifié et se lierait préférentiellement à la forme pré-fusion [58]. Contrairement à la protéine F du VRS, la protéine F-hMPV ne possède pas de site antigénique unique équivalent au site ø de la protéine F-VRS. Des études tridimensionnelles de la protéine F-hMPV, stabilisée en forme pré-fusion, ont révélé que le site correspondant au site antigénique ø de la F-VRS est masqué par des résidus glycosylés. Chez le VRS, la protéine F ne porte qu’un seul site de
Dans le cas de la F-hMPV, le site homologue comporte trois sites de glycosylation. Trois résidus N-glycans recouvrent cette région de la protéine F-hMPV en forme pré-fusion, ce qui masque le site antigénique et empêche la reconnaissance par des anticorps [19, 147, 160, 186, 198, 255]. Ces études corrèlent avec les récentes études d’immunogénicité faites avec une protéine F-hMPV, stabilisée en forme pré-fusion, évoquant l’absence d’anticorps neutralisants spécifiques à cette forme ainsi qu’une immunogénicité équivalente à celle induite par la protéine sauvage [19].
Figure 6. Sites antigéniques retrouvés sur les différentes formes de la protéine F du VRS et sites antigéniques correspondants chez le hMPV.
(a) Représentation 3D des formes pré- et post-fusion de la protéine F-VRS avec les sites antigéniques présents sur chacune des formes. La forme pré-fusion se retrouve à gauche, la forme post-fusion à droite. (b) Comparaison des sites antigéniques retrouvés sur les gènes du VRS et du hMPV (adapté de [188]).
La protéine F constitue une des cibles principales du hMPV pour la production d’anticorps neutralisants puisqu’il s’agit du principal antigène immunogène du virus. Plusieurs études ont démontré que le degré de protection offerte suite à une immunisation avec la protéine F du hMPV est adéquat, alors que les autres protéines de surface n’induisent pas une réponse immune protectrice [4, 57, 204]. Les études comparatives récentes entre la forme pré-fusion et post-fusion chez le VRS offrent de nouvelles possibilités de vaccins plus performants. Cependant, les vaccins à base de F pré-fusion sont nettement moins stables. Dû à son important potentiel vaccinal, la protéine de fusion F demeure la protéine la plus étudiée du hMPV.
1.3.1.2. Glycoprotéine de surface G
La protéine d’attachement G du hMPV est une glycoprotéine de surface de type II qui contient entre 217 et 236 acides aminés [29]. Pour le VRS et le hMPV, le domaine C-terminal hydrophile est situé à l’extérieur, alors que le domaine N-C-terminal est ancré dans la membrane du virion. L’ectodomaine présente une haute concentration en résidus sérine, thréonine et proline. De plus, de nombreux sucres peuvent être liés aux résidus O et N, ce qui peut modifier la structure tridimensionnelle de la protéine [133]. Le haut degré de glycosylation des protéines G serait un vestige des mucines et conférerait une structure non globulaire à la protéine. La protéine G est hypervariable chez la famille des
Pneumoviridae. Chez le VRS, qui a été le plus étudié, il y a plus de 45% de variabilité
entre les sous-groupes [133]. Pour hMPV, on note seulement 31-35% de similarité entre les sous-groupes A et B [244]. Cette grande variabilité pourrait être reliée au système d’évasion du virus face au système immunitaire. Plusieurs virus modifient leurs protéines afin d’échapper aux défenses de l’hôte, ainsi les séquences très variables permettent aux
Pneumoviridae de persister.
Bien que la protéine G soit considérée comme la protéine d’attachement du virus, ce dernier peut se lier à sa cible en absence de celle-ci, notamment via la protéine de fusion F [62]. La protéine G n’est donc pas indispensable à la réplication virale. Une étude a démontré qu’un virus hMPV dont la protéine G est supprimée peut se répliquer in vitro et in vivo. Toutefois, ce virus est atténué chez les primates [139]. Pour le modèle du hamster, un virus sans protéine G se réplique 40 fois moins efficacement que le virus sauvage au niveau des voies respiratoires inférieures.
Finalement, des études chez le rat des cotonniers ont démontré que des anticorps anti-protéine G ne sont pas neutralisants in vitro et ne protègent pas in vivo [252].
1.3.1.3. Petite protéine hydrophobe SH
La petite protéine hydrophobe (SH) du hMPV est une glycoprotéine transmembranaire de type II. Il s’agit d’une protéine de 179 acides aminés, la plus grande des protéines hydrophobes de la famille Pneumoviridae. En comparaison, la protéine hydrophobe du VRS ne compte que 65 acides aminés [180]. Similaire à la glycoprotéine de surface G, la SH est une protéine variable avec 60.7% à 64.4% de similarité, en acides nucléiques,
entre les différents groupes et 84.7% - 88.7% au niveau de différents sous-groupes [300]. Elle existe sous au moins trois formes différentes qui sont définies par le niveau de glycosylation, la forme non-glycosylée, la N-glycosylée et la hautement glycosylée en ordre croissant [26].
Son rôle n’a toujours pas été complètement élucidé. Toutefois, des études ont montré qu’elle n’est pas nécessaire à la réplication in vitro et in vivo. Une diminution non significative de la réplication a été notée chez les primates non humains suite à la délétion de la SH. Une délétion combinée de la protéine G et SH produit un virus capable de se répliquer, mais avec un rendement 600 fois inférieur au niveau des voies respiratoires supérieures comparé au virus sauvage [29].
La protéine SH n’est pas considérée comme un antigène de choix puisque des études d’immunisation, chez le hMPV, ont anciennement démontré sa faible contribution à la production d’anticorps neutralisants [252]. Cependant, une étude plus récente utilisant l’ectodomaine de la petite protéine hydrophobe du VRS combinée au système d’huile DepoVax (Immunovaccine™) a montré un haut potentiel immunogène de ce peptide. Cette découverte ouvre la voie à de nouvelles investigations possibles avec la protéine SH-hMPV [154].
1.3.2. Protéine matrice M
Cette protéine non glycosylée de 254 acides aminés forme la couche interne de l’enveloppe virale. Sa séquence nucléique est hautement conservée, plus de 90% de similarité entre les différentes souches virales et plus de 98% en acides aminés [213]. Des études par cristallographie révèlent une structure dimérique en forme de diamant avec un côté concave, qui agirait avec la membrane virale [196], et un côté convexe qui servirait à ancrer des résidus de calcium pendant la réplication virale. Le dimère est formé par deux monomères liés par une large surface hydrophobe, cette interaction donne la forme spécifique de la protéine [159].
Similairement à la protéine M du VRS, son rôle principal est le bourgeonnement du virus à partir des cellules infectées [121, 264]. La protéine M tapisse l’intérieur de la membrane cellulaire au site de bourgeonnement du virus, la migration du complexe du génome viral au site tapissé initie le bourgeonnement. Des études ont démontré qu’elle est aussi
impliquée dans la suppression de la réplication du génome viral afin de promouvoir l’assemblage des particules[103, 300].
Finalement, il a été démontré, in vitro, que la protéine de matrice peut activer les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) et induire leur maturation ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires [14].
1.3.3. Protéines du complexe de réplication (N, L et P)
La protéine de la nucléocapside (N) et la protéine P du hMPV sont plus petites que leurs protéines homologues de la famille des Pneumoviridae [11, 213, 254, 261]. La protéine L est toutefois de taille similaire [254]. Elles sont toutes les trois hautement conservées, à près de 90% d’identité en acides nucléiques, en moyenne, entre les différentes souches [213].
Les génomes d’ARN sens et anti-sens s’enroulent autour des anneaux formés par la nucléoprotéine pour former des complexes résistants aux RNases. Les génomes sont donc présents sous forme d’ARN protégés par la nucléocapside qui servent de gabarits pour la réplication par le complexe polymérase [261]. L’étape de synthèse de nouveaux génomes est couplée à l’encapsidation, afin de protéger les nouveaux génomes.
La phosphoprotéine P est un adaptateur qui est impliqué dans l’interaction entre N et L. Des études ont montré qu’une interaction entre N et P est nécessaire à la formation des corps d’inclusions viraux [74]. L’interaction se fait par le domaine C-terminal de la protéine P avec la protéine N [100]. Les domaines N- et C-terminal de la nucléoprotéine ne sont pas requis pour l’interaction. Toutefois, le domaine N-terminal est indispensable pour la formation des corps d’inclusion.
Chez le VRS, P est un cofacteur essentiel à la polymérase L. Elle permettrait, entre autres, des changements de conformation facilitant l’accès à l’ARN viral, l’accès aux promoteurs et serait impliquée dans le processus d’élongation [81]. Elle aurait une fonction similaire chez le hMPV.
La protéine L est l’unité polymérase. Chez le VRS, elle possède un domaine polymérase ainsi qu’un domaine impliqué dans l’ajout des coiffes polyA [166]. Une fonction similaire serait présente pour le hMPV.
Finalement, le complexe de réplication virale formé des unités N, P et L serait suffisant pour la transcription et la réplication du génome du hMPV [297]. La délétion d’une des trois protéines bloque le processus. Contrairement au VRS, l’unité M2-1 n’est pas requise pour une activité du complexe [90] in vitro, alors que des études ont montré sa nécessité
in vivo. Le rôle de la protéine M2-1 demeure donc à étudier [38, 142], mais des études lui
attribuent une augmentation de l’efficacité de la polymérase [56, 95].
1.3.4. Protéine M2-2
Le gène M2 de tous les pneumovirus code pour deux protéines produites à partir de CLO chevauchants. Produite à partir du même gène que la protéine M2-1, la M2-2 est une petite protéine de 71 acides aminés [271]. Elle résulte de la lecture alternative de l’ARNm M2, à partir d’un CLO interne [28].
Son rôle principal est la régulation de la transcription et la réplication virale. Des mutants recombinants sans M2-2 révèlent une augmentation de la transcription [38]. La protéine se lie à la polymérase L et ses domaines N et C-terminaux exercent une inhibition de ses fonctions, ce qui résulte en la diminution de la réplication et la transcription. Les deux domaines semblent essentiels à la fonction de la protéine puisque des mutants n’exhibent pas de fonction sans ces derniers [142]. Une étude a aussi montré qu’une délétion de la protéine entraîne une augmentation des mutations virales ainsi qu’une atténuation in vivo [239]. Ces résultats proposent que M2-2 soit une protéine multifonctionnelle qui nécessite encore des études pour déterminer son implication au sein du virus.
1.4. Cycle de réplication virale :
Le cycle de réplication du hMPV implique plusieurs processus succincts dont certains ont été bien étudiés alors que d’autres demeurent à élucider. Le processus global d’entrée, de réplication et de sortie du virus est similaire à celui du VRS. Le cycle réplicatif global débute par l’attachement et la pénétration du virus, suivi de la transcription virale, la synthèse des protéines virales, la réplication génomique et le bourgeonnement du virus (figure 7).
Figure 7. Cycle de réplication du hMPV.
La figure montre l’entrée virale, la transcription protéique, la réplication génomique ainsi que l’assemblage viral par bourgeonnement (adapté de [241]).
1.4.1. Attachement
L’attachement du virion, in vitro, à sa cellule cible est médié via l’attachement au glycosaminoglycanes (GaGs) ainsi qu’à l’intégrine αvβ1 [66]. La première étape de l’attachement s’effectue entre la protéine de surface G et les GaGs [91]. Des études ont montré que cette interaction ne serait qu’une initiation de l’attachement viral puisque des interactions entre la surface cellulaire et les protéines de surface SH et F sont observées par la suite. Des études ont révélé que la délétion de la protéine G et/ou SH n’affecte pas la réplication virale in vitro, ce qui implique que leur action semble accessoire. Ces études montrent que la protéine de fusion F est capable de médier l’attachement et la pénétration du virus à l’intérieur de la cellule cible seule [29]. En effet, la F serait capable d’interagir avec les résidus d’héparine sulfate à la surface cellulaire [92], ces mêmes résidus sont reconnus par la protéine G. Elle peut aussi se lier à l’intégrine αvβ1 [66]. Cependant, la réplication virale in vivo est limitée en absence des autres protéines de surface, ce qui
indique une suite d’interactions complémentaires des protéines de surface pour un attachement et une pénétration efficace du virion.
L’attachement serait donc initié par la protéine G puis les protéines SH et F seraient impliquées à leur tour. Il est à noter que la délétion de la protéine SH n’atténue que faiblement la réplication virale, alors que la délétion de la G l’atténue grandement [29]. Ces études suggèrent que le mécanisme d’attachement serait alors une interaction entre les protéines F et G avec leurs récepteurs cellulaires, toutefois le mécanisme exact demeure non élucidé.
1.4.2. Fusion
L’entrée du virion dans la cellule cible se fait par un processus de fusion membranaire, commun à tous les pneumoviridae, entre la membrane virale et cellulaire. La protéine de fusion F est cruciale. L’initiation de la fusion est lente, mais devient rapide une fois amorcée [13].
La protéine de fusion F est présente sous forme d’un précurseur inactif appelé F0 et doit être clivée pour l’initiation de la fusion virale [86] (figure 8).
Figure 8. Représentation schématique de la protéine de fusion F du hMPV.
La figure montre la protéine F sous sa forme précurseur F0 ainsi que les deux unités F1 et F2 générées après clivage, dont le site est en amont du FP. FP, peptide de fusion; HRA/HRB, répétition de sept acides aminés; TM, domaine transmembranaire; CT, domaine cytosolique; S-S, ponts disulfures; RGD, domaine d’adhésion cellulaire (adapté de [61]).
Le clivage permet l’exposition du peptide de fusion. Le peptide de fusion s’insère dans la membrane de la cellule cible pour ancrer le virus à sa cible. La suite du mécanisme de fusion implique les régions Heptad Repeats A et B (HRA, HRB) situées sur la sous-unité
F1. Durant le processus de fusion, il y a un repliement des régions HR pour former une longue structure de superhélice (coiled-coil) dont l’extrémité N-terminale (peptide du fusion) adjacente au motif HRA est insérée dans la membrane cible. L’étape ultime implique la portion C-terminale, adjacente au motif HRB, qui va former une boucle de six hélices (6HB) avec le motif HRA. Cette interaction entre les deux motifs HR rapproche les membranes de la cellule cible et du virus afin de permettre leur fusion [186, 295] (figure 9). Ce mécanisme est commun à tous les pneumoviridae. L’insertion du peptide de fusion marque le début d’une multitude de changements conformationnels qui résultent en une forme hautement stable, la forme post-fusion. Il est probable que plus d’une protéine F soit nécessaire pour la fusion efficace des membranes [188].
Figure 9. Mécanisme de fusion virale.
Les processus d’insertion du peptide de fusion, de rapprochement des membranes virale et cellulaire ainsi que de la fusion des deux sont présentés.
La fusion des membranes déverse le contenu du virion dans la cellule pour la suite du processus d’infection. La fusion médiée par les protéines F des pneumoviridae les distingue des autres virus en leur permettant de fusionner en absence d’acidification du milieu externe [241].
1.4.3. Transcription virale :
Suite à la fusion, la nucléocapside virale se retrouve dans le cytoplasme cellulaire. Les mécanismes de transcription du hMPV sont similaires à ceux du VRS. L’initiation de la transcription se fait par l’ARN polymérase sur le gabarit d’ARN génomique. La polymérase amorce la transcription du gène via une région d’initiation (leader) et termine la transcription lorsqu’elle rencontre les régions terminales. Les séquences initiatrices et terminales flanquent chaque gène du génome [233]. Chez la majorité des pneumovirdae, ces deux régions sont complémentaires. Toutefois, pour hMPV, elles le sont moins et une seule des deux régions permet la transcription [124].
La transcription d’un gène génère un ARNm qui possède une coiffe ainsi qu’une queue polyA. Lorsque la polymérase termine la transcription d’un gène, elle ne se détache pas, elle migre vers le gène suivant en libérant l’ARNm du premier transcrit.
L’ARN polymérase a tendance à se détacher lors de la transcription, ce qui crée un gradient dans l’expression des gènes. Elle se détache lors de sa migration sur les régions intergéniques du génome, donc plus un gène est situé en aval, moins il est exprimé. Ceci crée une diminution des ARNm à l’extrémité 5’ du génome [54, 148]. La mauvaise terminaison de la transcription peut aussi diminuer la quantité d’ARNm en créant des ARNm contenant des séquences d’autres gènes. La présence du CLO au milieu de ces ARNm empêche leur traduction efficace et se résume par une diminution protéique [119, 197]. Le gradient dépend donc de la position, mais aussi des séquences terminales de chaque gène. Ce gradient n’est toutefois pas très prononcé. Une des exceptions à cette règle est le gène de la polymérase L. La faible quantité d’ARNm L serait toutefois due à un processus de dégradation post-transcriptionnel plutôt qu’au détachement de la polymérase [54]. La traduction des ARNm se fait par la machinerie de la cellule infectée, elle n’implique pas les protéines virales.
1.4.4. Réplication du génome
La réplication virale implique l’arrêt de la synthèse d’ARNm par la polymérase pour qu’elle synthétise des génomes viraux. Chez le VRS, la protéine M2-2 est étroitement reliée à ce changement. Des études ont montré que l’accumulation de la protéine M2-2 stimule l’activité de réplication aux dépens de la transcription. Cette action permettrait la génération de génomes viraux lorsque suffisamment de protéines virales ont été produites pour former les particules virales [25]. Une action similaire serait observable chez le hMPV, toutefois les études se contredisent sur l’importance de l’effet au sein de réplication du virus [38].
Le mécanisme de réplication du génome est standard pour un virus à ARN brin négatif. Initialement, l’ARN polymérase ARN dépendante synthétise un génome complémentaire à l’ARN négatif. Le produit est un ARN positif qui est une copie parfaitement complémentaire au génome viral. La polymérase copie ensuite ce segment positif pour synthétiser plusieurs ARN brin négatif qui sont les nouveaux génomes viraux [51].
1.4.5. Assemblage des particules virales
L’assemblage des particules virales chez le hMPV n’a pas encore été étudié en profondeur, la majorité des informations sont générées à partir des études menées chez le VRS. Lorsque les ARNm sont produits par la polymérase L, ils sont traduits par la machinerie cellulaire afin de générer les différentes protéines virales. Certaines des protéines virales nécessitent des modifications post-traductionnelles, telles les protéines F, G et SH qui doivent être glycosylées. Ces glycoprotéines seront synthétisées au niveau du réticulum endoplasmique et navigueront à travers la voie de sécrétion de protéine de la cellule pour subir les modifications nécessaires et migrer à la surface de la cellule [250]. La synthèse des génomes viraux est couplée à leur encapsidation par la protéine N et la liaison des protéines P et L. Il a été démontré que la synthèse de ces protéines ainsi que la production des nouveaux génomes se fait dans des corps d’inclusions. Ces structures cellulaires présentent des quantités concentrées des protéines virales, ce qui facilite la réplication et l’assemblage du complexe de réplication virale [163]. La migration de ce complexe vers la surface de la cellule demeure à l’étude. Il impliquerait la protéine M ainsi que le cytosquelette de l’hôte [160]. La sortie du virion se fait par bourgeonnement. Le virus acquiert alors son enveloppe lipidique ainsi que ses protéines de surface [250]. La libération de la particule virale par détachement de la cellule hôte pourrait être entièrement autonome et ne nécessiterait pas une action cis par les protéines cellulaires. Toutefois, ce mécanisme demeure moins bien compris et doit être mieux étudié [160].
1.5. Épidémiologie
Bien que les infections avec le virus hMPV puissent survenir tout au long de l’année, la majorité des cas sont répertoriés durant les mois de la fin de l’hiver et début du printemps. Des études ont montré que le virus sévit durant la même période que le VRS et l’influenza. Toutefois, la distribution peut varier selon les régions géographiques où le hMPV sévit après le virus influenza [46, 136, 193] (figure 10). La distribution représentée est pour l’hémisphère Nord du globe, les mois de juin et juillet sont ceux à risque dans l’hémisphère Sud.
Figure 10. Distribution saisonnière de quatre virus respiratoires (adapté de [136]).
Des cas d’infections au hMPV ont été répertoriés à l’échelle mondiale, sur tous les continents (figure 11).
Figure 11. Distribution géographique du hMPV.
Les génotypes associés sont les résultats observés pour la saison 2010 (adapté de [136]).
Il a été montré que les différents génotypes viraux n’ont pas de limitations géographiques ni temporelles. De plus, plusieurs génotypes peuvent circuler simultanément au sein d’une même population. La transmission virale se fait principalement par aérosolisation de
gouttelettes infectieuses d’humain à humain. Les enfants en bas âge, les immunosupprimés ainsi que les aînés sont les plus à risque [206].
1.6. Manifestations cliniques
1.6.1. Infection et populations à risque
Le hMPV cause des infections aiguës des voies respiratoires qui peuvent avoir de nombreuses complications et conséquences. Pour la majorité de la population, il ne constitue toutefois pas un danger immédiat. Les enfants de moins de 5 ans, les personnes immunodéprimées ainsi que les personnes âgées sont plus susceptibles aux complications et constituent donc la population à risque.
La séroprévalence dans la population a été évaluée à près de 100% pour les individus de 5 à 10 ans [206]. Des réinfections peuvent avoir lieu tout au long d’une vie, comme le démontrent des évaluations sérologiques périodiques [244]. Ces réinfections peuvent être occasionnées par une réponse immunitaire insuffisante lors de la primo-infection, l’immunité mémoire déficiente ou une infection causée par un génotype différent. La variation génétique est le mécanisme d’évasion le moins fréquent chez le hMPV en comparaison avec des virus comme l’Influenza où il s’agit du principal mécanisme. Plusieurs études ont montré qu’une immunité mémoire peu efficace fait suite à une infection par le hMPV. Les mécanismes d’évasion du système immunitaire seraient en cause, ce qui explique les complications liées aux infections ainsi qu’aux réinfections. Toutefois, ces mécanismes demeurent encore à être élucidés [80, 82, 83, 95, 206, 244].
1.6.2. Co-infections
Puisque les virus hMPV et VRS circulent durant les mêmes périodes de l’année, des co-infections virales peuvent survenir. Plusieurs études ont démontré des taux de co-infection < 10% chez les patients et la sévérité de l’infection serait augmentée grandement. Une étude menée en Angleterre rapporte que chez les enfants admis aux soins intensifs, 70% démontrent des co-infections hMPV/VRS. Ces données suggèrent une exacerbation des symptômes reliée à la co-infection où l’infection par le hMPV viendrait augmenter la pathologie du VRS chez une population non-immunosupprimée [87, 107, 278, 287]. Dans une autre étude du Royaume-Uni, les données montraient une chance accrue d’admission
aux soins intensifs lors de co-infections. Toutefois, suite à de nombreuses investigations, la co-infection entre les deux virus demeure un phénomène rare [136, 246].
En 2002, une nouvelle maladie respiratoire a vu le jour. Le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), provenant de l’Asie du Sud-ouest, fut attribué à un nouveau coronavirus. Il a été montré qu’au Canada ainsi qu’en Chine, une large proportion des patients admis pour du SRAS étaient aussi positifs pour le hMPV. Il n’y a pas de données qui démontrent une amplification des symptômes ou une aggravation de l’état des patients co-infectés. Davantage d’études sont nécessaires afin de comprendre l’effet de ce type de co-infection [47, 48, 150, 216].
Finalement, des pneumonies bactériennes peuvent survenir lors d’infections par le hMPV. Contrairement aux infections avec l’influenza, où les pneumonies bactériennes sont fréquentes, celles associées au VRS ainsi qu’au hMPV sont plutôt rares. Peu de recherches ont été menées sur ce sujet, ce qui laisse place au questionnement sur l’effet réel [111, 136].
1.6.3. Syndromes cliniques
Le hMPV et le VRS causent tous les deux des infections des voies respiratoires supérieures/inférieures et les symptômes sont similaires entre les deux virus. L’infection débute dans les voies supérieures et se propage aux voies inférieures dans 25 à 40% des cas [104]. La maladie débute par des symptômes de fièvre, toux, hypoxie, tachypnée et des infiltrats ou de l’hyperinflation peuvent être observés suite à une radiographie. Les infections asymptomatiques sont peu courantes chez les enfants, seulement 1 enfant sur 86 présentait ce type d’infection selon une étude [18, 30, 87, 183, 210, 270, 273, 287].
1.6.4.
Pathologie et complications liées à l’infection par le hMPV
1.6.4.1. Enfants
La majorité des études réalisées sur le hMPV ont eu lieu chez les enfants en bas âge, puisqu’ils sont les plus touchés par ces virus. Les informations générales sont donc basées sur cette population. Le hMPV et le VRS provoquent des infections des voies respiratoires supérieures et inférieures. Les manifestations cliniques sont les mêmes pour deux virus c’est pourquoi un diagnostic moléculaire est nécessaire pour confirmer le virus
en cause. La plupart des patients sont admis pour une bronchiolite, une bronchite ou une pneumonie [30]. Le temps d’incubation virale est de 3 à 5 jours pour le VRS, mais n’a pas été défini pour le hMPV. L’âge médian de la primo-infection se situe autour de 6 mois et la quasi-totalité des enfants a une sérologie positive à deux ans. La séroprévalence est estimée à près de 100% à > 5 ans [76, 168].
L’infection débute dans les voies supérieures et cause de la toux, de la fièvre, de la rhinorrhée, du sifflement respiratoire et des rétractions thoraciques. D’autres symptômes ont été rapportés, tels que des vomissements, de la diarrhée et de la salivation accrue, mais à des taux faibles [30]. L’infection peut progresser vers les voies respiratoires inférieures, ce qui cause des complications plus sévères. De 5 à 15% des infections des voies respiratoires seraient causés par le hMPV et il serait responsable d’environ 10% des hospitalisations infantiles, ce qui en fait la troisième cause mondiale derrière le VRS et l’influenza. Certaines recherches ont montré une corrélation entre la sévérité de la maladie et le génotype du virus. Dans ces études, des symptômes plus sévères étaient observés chez des patients infectés avec le hMPV type B. Cependant, d’autres études viennent contredire ces hypothèses, alors que certains affirment qu’il n’y a pas de différence. Le même phénomène est observé suite à des comparaisons du hMPV et du VRS où les résultats sont variables [6, 87, 156, 174, 212, 293].
La progression de l’infection est associée principalement avec le développement des bronchites, des bronchiolites et des pneumonies. Le lien entre l’infection et le développement de l’asthme a été rapporté, mais n’a pas été confirmé. Les données se contredisent à définir si l’hMPV cause directement l’exacerbation des symptômes d’asthme. Bien que certaines études ne rapportent pas de lien, d’autres ont identifié le hMPV chez des patients avec de l’asthme aigu et du « wheezing » [102, 285, 287, 288].
Quelques cas d’encéphalites virales liés au hMPV ont été rapportés, où certains patients sont restés physiquement et cognitivement affectés suite à une détérioration rapide de leur état de santé. Un cas fatal avec encéphalite hMPV a été rapporté [10, 96, 235, 240].
Finalement, le fardeau économique relié aux hospitalisations est non négligeable. Une étude, aux États-Unis, estime qu’il y a 27,000 hospitalisations par année chez les enfants < 18 ans avec un coût de 277 millions de dollars US. Ces chiffres sont basés sur les taux moyens d’hospitalisation pour le hMPV qui sont similaires à ceux de l’Influenza (moyenne
de 36,4 sur 100,000 jeunes < 18 ans). Malgré le nombre élevé d’hospitalisations, peu de décès ont été rapportés chez des enfants sans autres pathologies [68, 84, 110, 289].
1.6.4.2. Adultes sains
Chez les adultes sains, les infections avec le hMPV sont plutôt rares, mais possibles. La majorité des infections sont sans danger et asymptomatiques ou causent des symptômes bénins [113]. Cependant, une étude rapporte des taux d’infection de 3,4% chez les adultes se présentant pour des infections aiguës des voies respiratoires. Selon une autre investigation, aucun patient n’a été testé positif pour le hMPV sur une période de trois mois. Toutefois, cette période est considérée statistiquement trop courte [31, 167]. Les taux d’incidence varient grandement allant de 2,2 à 11% selon les études, mais toutes démontrent la possibilité d’infection sévère chez l’adulte sain [118, 136, 256]. Néanmoins, le hMPV peut causer les mêmes complications chez les adultes que chez les enfants, ce qui démontre la capacité du virus à contourner le système immunitaire. Certains facteurs peuvent influencer la prédisposition aux infections. Les facteurs les plus importants sont l’âge avancé ainsi que les maladies cardiopulmonaires et l’atteinte par la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Chez les patients avec MPOC, des hypothèses ont été émises en lien avec l’exacerbation de la maladie par l’infection avec le hMPV, mais n’ont pas encore été confirmées hors de tout doute [177, 256]. Les faibles taux d’infections aiguës expliquent la petite proportion d’études consacrées au virus hMPV chez l’adulte.
1.6.4.3. Aînés
La majorité des infections par le hMPV chez l’adulte se retrouvent chez les > 65 ans [248]. Dans une étude au Canada, 46% des patients infectés par le hMPV étaient âgés de plus de 65 ans, dont 60% ont nécessité une hospitalisation. Cette même équipe a examiné l’éclosion d’une infection à hMPV au sein d’une unité de soins permanente pour aînés. Vingt-sept pour cent des patients totaux ont été infectés, mais les unités les plus touchées affichaient jusqu’à 72%. La complication la plus courante chez ces patients est la pneumonie. Pour cette population, la comorbidité est de presque 100%. Dans les deux études, tous les patients hospitalisés présentaient au moins une condition médicale supplémentaire [31, 33, 89, 162, 279].
Chez les aînés, les taux de morbidité sont parmi les plus élevés [33]. Des hypothèses ont été émises concernant les hauts taux de morbidité. L’affaiblissement de l’immunité avec la progression de l’âge est une des principales théories. L’âge provoque une altération qualitative et quantitative de l’immunité. Chez le modèle murin, une diminution avec l’âge de la réponse spécifique antivirale des cellules T effectrices a été observée. Une autre théorie est la réponse exagérée inflammatoire en contraste avec la faible immunité. Davantage de recherche est nécessaire afin de mieux comprendre le rôle de l’immunité dans la mortalité chez les personnes âgées suite à une infection à l’hMPV [33, 37, 129, 130, 214, 257].
1.6.4.4. Adultes immunosupprimés
Comme pour la majorité des infections, les personnes les plus à risque sont les patients immunosupprimés. En l’absence du système immunitaire, les virus peuvent se répliquer sans limitation, ce qui provoque une exacerbation des symptômes et peut causer la mort. Cette catégorie inclut aussi les patients ayant subi une transplantation. Plusieurs études montrent des infections aiguës dues au hMPV qui progressent souvent vers une pneumonie. Les taux de morbidité sont particulièrement élevés, avec une mortalité allant de 30 à 100% [40, 155, 178, 286]. Les mêmes résultats sont observables chez les enfants immunosupprimés [209]. Malgré le nombre élevé d’études, il est difficile de déterminer l’impact exact du virus hMPV dans la population immunosupprimée puisqu’il y a beaucoup de surinfections bactériennes et fongiques associées [155]. L’incapacité à contrôler la réplication virale a été évoquée pour expliquer la morbidité. Cependant,des recherches à long terme sont nécessaires pour comprendre les mécanismes impliqués dans l’infection à hMPV chez les sujets immunosupprimés.
1.7. Réponse immunitaire
Plusieurs mécanismes orchestrent l’immunité contre le hMPV. La première ligne de défense est la barrière physique du glycocalyx des cellules épithéliales de surface des muqueuses, le mucus et le balayement ciliaire. Les « Pathogen Recognition Receptors » (PRR) sont les principaux acteurs dans la reconnaissance du virus suite à son entrée. Ces récepteurs sont liés à l’activation des voies de signalisation responsables de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires permettant l’initiation de la réponse immunitaire. Il a été montré que le hMPV peut modifier les voies de signalisation en agissant sur les différents
récepteurs de reconnaissance. Le hMPV régule l’inflammation en se liant aux récepteurs « Toll-Like » (TLR) tout en interférant avec la production des interférons [50]. Les infections par le hMPV et le VRS sont aussi associées à un dérèglement du profil de transcription des cellules épithéliales et peuvent affecter jusqu’à 900 gènes. Ces cellules et les macrophages sécrètent, in vitro, un large spectre de cytokines pro-inflammatoires et sont les principaux responsables du recrutement des autres cellules immunitaires en réponse à l’infection. Parmi les cytokines sécrétées on retrouve l’IL-1, IL-8/CXCL8, RANTES/CCL5, IL-10, MIP-1α/CCL3, MCP-1/CCL2, IP-10/CXCL10, IL-6, TNFα et les interférons type I et III. Des observations similaires ont été faites in vivo [15, 20, 200, 231]. Le recrutement des cellules immunes au site d’infection contribue à l’élimination virale, mais peut aussi contribuer à l’exacerbation de la maladie. Une étude a notamment montré des dommages tissulaires associés à la libération de granulocytes par les neutrophiles malgré leur effet antimicrobien bénéfique [189, 191].
Trois facteurs immunitaires ont été identifiés pour expliquer la plus grande susceptibilité des enfants et les personnes âgées aux infections hMPV. Tous ces facteurs sont reliés aux cellules lymphocytaires. Chez les jeunes enfants, le système immunitaire est en pleine croissance et peu de cellules matures sont présentes, ce qui limite la capacité de contrôler l’infection virale. Chez les aînés, la sénescence immunitaire a été émise comme hypothèse pour expliquer la sévérité de la maladie. L’homéostasie immunitaire aide à la diminution des infections au hMPV chez les adultes sains. Finalement, des études ont montré qu’un débalancement des réponses immunes Th1/Th2, favorisant la réponse Th2, peut accentuer la sévérité des symptômes [36, 228, 237].
1.8. Changements histopathologiques
L’infection des voies respiratoires par le hMPV cause plusieurs changements au niveau des tissus pulmonaires. Des biopsies effectuées chez des patients présentant des infections aiguës des voies respiratoires, causées par le hMPV, ont révélé plusieurs changements similaires. L’infection est caractérisée par des lésions pulmonaires sévères et organisées. Ces lésions sont localisées et se présentent sous forme de dommages alvéolaires diffus accompagnés par la formation de membranes hyalines ainsi que des foyers de bronchiolites oblitérantes caractéristiques des pneumonies. L’infection par le hMPV est aussi accompagnée par l’apparition de pneumocytes de type II élargis avec des noyaux hyperchromatiques maculés similaires à ce qui est retrouvé lors des infections par
l’adénovirus [71, 259]. Une étude des lavages bronchoalvéolaires et des biopsies provenant de jeunes patients infectés par le hMPV a également montré une dégénérescence des cellules épithéliales, de la nécrose, une infiltration par des neutrophiles, l’accumulation de mucus ainsi que des macrophages chargés d’hémosidérine. Toutefois, ces patients présentaient des co-infections et des études en absence de comorbidités n’ont pas été effectuées [241, 275].
1.9. Diagnostic et détection du hMPV
1.9.1. Diagnostic moléculaire
Le diagnostic viral peut se faire de plusieurs manières. Les méthodes les plus répandues sont le diagnostic moléculaire via une technique PCR et la culture virale sur cellules. D’autres techniques existent, tels les tests sérologiques ou les tests de couplage avec des anticorps de reconnaissance. Toutefois, ces derniers sont peu ou pas utilisés.
La détection par amplification d’ADN en temps réel est la méthode la plus rapide et la plus efficace à ce jour. Lorsqu’un patient présente des symptômes s’apparentant à une infection hMPV et/ou VRS, une aspiration nasopharyngée, un écouvillon nasal ou un lavage nasal est effectué.
La majorité des études utilisent des amorces pour les protéines N, L, P, M ou P puisqu’il s’agit de gènes hautement conservés au sein du virus [34, 59, 296].
L’utilisation de PCR multiplex permet de couvrir plusieurs gènes ainsi que plusieurs virus différents dans un même échantillon, ce qui accélère le diagnostic. Les PCR multiplex peuvent aussi être couplées à la technique de la PCR en temps réel (RT-PCR). Cette technique utilise des amorces avec des rapporteurs intégrés qui émettent un signal chaque fois qu’ils sont incorporés dans le nouveau brin d’ADN synthétisé. Le signal augmente à chaque cycle de réplication de façon exponentielle et permet de détecter le virus en fonction de la charge virale initiale [263]. Plus l’échantillon est concentré, plus la détection sera rapide.
1.9.2. Culture cellulaire
Malgré l’efficacité des techniques de diagnostic moléculaire, une culture virale peut être effectuée afin de confirmer le diagnostic ainsi que pour la conservation de la souche virale.
Le hMPV a un spectre restreint de cellules permissives. Néanmoins, la culture virale peut se faire sur des lignées cellulaires telles les cellules LLC-MK2 et Vero. Les deux sont des lignées cellulaires dérivées de cellules rénales de singes [70, 266]. Le virus est typiquement cultivé dans des milieux commerciaux tel l’OptiMEM et la température optimale est de 37°C avec une atmosphère supplémentée de 5% de CO2. Le site de clivage de la protéine de fusion du hMPV ne porte pas la séquence optimale pour le clivage, ce qui nécessite l’ajout de trypsine lors de la culture in vitro puisque les cellules utilisées ne produisent pas de furine. Des études ont montré la capacité du virus à muter pour s’adapter à une culture en absence de trypsine, cependant les titres viraux sont diminués [238, 266]. La culture du VRS est plus rapide que celle du hMPV, qui peut prendre jusqu’à 21 jours. Puisque la protéine de fusion F est localisée à la surface cellulaire lors de l’infection, les virus forment des syncytia, qui sont de multiples cellules fusionnées, observables au microscope [243] (figure 12). Les différentes souches virales peuvent donner une multitude d’effets cytopathiques différents. La taille et la forme des syncytia varient selon le virus isolé. Il ne semble pas y avoir de corrélation entre le type de syncytia formés et le groupe du virus. Les deux groupes du hMPV peuvent donner des effets cytopathiques similaires.
Figure 12. Effets cytopathiques observes suite à une infection hMPV in vitro.
Les effets observés à gauche sont liés à une infection avec une souche B2 en comparaison aux effets causés par une souche A1 à droite (adapté de [5]).
1.10. Modalités thérapeutiques
1.10.1.
Généralités
Il n’y a présentement pas de traitements spécifiques ni de vaccins contre le hMPV approuvés chez l’humain. Les traitements administrés aux patients sont des traitements de support en attente de l’autorésolution de l’infection. L’académie pédiatrique américaine a émis des guides pour les infections par le hMPV et le VRS. Les soins de support sont nombreux. On dénote l’aspiration des sécrétions, le repositionnement de l’enfant, l’administration d’oxygène humidifié et de fluides intraveineux. Dans les infections les plus sévères, les patients peuvent nécessiter l’intubation afin de permettre la respiration. L’administration d’antibiotiques n’est pas recommandée à moins de co-infection bactérienne prouvée [265]. Quelques traitements sont approuvés pour soigner les cas les plus graves [291].
1.10.2.
Antiviraux
La ribavirine est un antiviral utilisé pour traiter les cas graves reliés aux infections à hMPV et VRS. La ribavirine est un analogue des nucléotides et son spectre d’action est très large, bien que son mode d’action ne soit pas entièrement compris. Des études animales montrent qu’il agit contre le VRS et le hMPV. Il est approuvé, aux États-Unis, depuis 1986 pour le traitement des infections au VRS en cas de dernier recours [277, 294]. Plusieurs études ont prouvé l’action neutralisante de la ribavirine contre le hMPV au même titre que le VRS. Cet antiviral exhibe un effet inhibiteur de la réplication virale in vitro et in vivo, en plus de moduler la réponse inflammatoire in vivo [114, 291]. L’utilisation principale de la ribavirine est chez les patients immunosupprimés qui présentent des symptômes très graves. Plusieurs articles montrent un succès de traitement d’une infection à hMPV chez des patients transplantés d’organes [143, 223, 247]. Cependant, une investigation chez des infections par le hMPV et le VRS en 2013 note que l’utilisation de la ribavirine prolonge le séjour des patients hospitalisés sans affecter la morbidité à 30 jours post-administration. Dans cette étude, le groupe ayant subi un traitement oral avec la ribavirine n’était pas significativement différent du groupe contrôle, 16% de mortalité contre 12%, respectivement [207].
