Méthodes thérapeutiques et valeur prédictive de MSI dans les CCR

Aujourd’hui, pour une localisation tumorale donnée, et notamment pour les CCR, la prise en charge des patients présentant une tumeur MSI ou MSS au diagnostic est identique, ne prenant pas en compte les différences phénotypiques majeures et les modalités de transformations distinctes qui existent entre ces deux types tumoraux. Deux types de traitement sont utilisés pour traiter un cancer colorectal : la chirurgie et les traitements médicamenteux que sont les chimiothérapies et les thérapies ciblées (anticorps monoclonaux et immunothérapies anti-ICK). Le recours à la radiothérapie peut avoir lieu dans les cas de cancers du rectum. Ces traitements peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. Ils sont adaptés au stade du cancer et leurs objectifs varient selon les cas ; ils ont pour visée principale la suppression de la tumeur et/ou des métastases, la réduction du risque de récidive et le ralentissement du développement de la tumeur et/ou des métastases (source INCa, 2016).

La chirurgie seule est le principal traitement du CCR de stades précoces localisés (I et II). Pour les stades II de haut grade et les stades III, la chimiothérapie est utilisée en adjuvant (traitement complémentaire secondaire à la chirurgie). Enfin les stades IV bénéficient de la chirurgie, de la chimiothérapie adjuvante, dans certains cas néo-adjuvante (avant la chirurgie) et des thérapies ciblées. Les différents protocoles de traitement sont détaillés dans cette section ainsi que la valeur prédictive de MSI dans ces contextes thérapeutiques.

6.a. Chimiothérapie

Il existe plusieurs protocoles de chimiothérapie utilisant en combinatoire quatre agents chimio-thérapeutiques principaux administrés aux patients atteints de CCR : le 5-FluoroUracil (5-FU), l’oxaliplatine (OXA), l’acide folinique ou leucovorine (LV) et l’irinotécan (IRI).

Le 5-FU est le composé standard des chimiothérapies dont l’activité anti-tumorale via l’induction de la mort cellulaire, a été mise en évidence à la fin des années 50 (Heidelberger et al., 1957). C’est une fluoropyrimidine métabolisée en plusieurs molécules actives capables d’une part d’inhiber l’activité de la thymidylate synthase (TS), impliquée dans la voie de biosynthèse de la thymidine et entraînant des cycles futiles de réparation, d’autre part leur incorporation au niveau de l’ADN et de l’ARN provoque l’arrêt de la fourche de réplication de l’ADN et de la transcription des ARN (Tajima et al., 2004). La leucovorine

(5′-formyltetrahydrofolate) est un stabilisateur de la liaison entre le 5-FU et la TS, potentialisant ainsi la cytotoxicité de ce dernier (Longley, Harkin and Johnston, 2003). L’oxaliplatine est un agent alkylant inducteur de pontages intra- ou inter- brins entre deux guanines empêchant la transcription et la réplication de l’ADN (Dilruba and Kalayda, 2016). Enfin, l’irinotécan est un inhibiteur de la topoisomérase I, causant la mort cellulaire par apoptose suite à l’induction de cassures simple brin et d’un blocage de la réplication (Hammond, Swaika and Mody, 2016).

Les associations de chimiothérapies adjuvantes sont utilisées selon le stade du CCR et la classification TNM : les patients de stade II de haut grade et de stade III reçoivent du FOLFOX (association de 5-FU, OXA et LV) et les stades IV ont une chimiothérapie néo-adjuvante et adjuvante de FOLFIRI (association de 5-FU, LV et IRI) et/ou de FOLFOX. Il est à préciser qu’un traitement de chimiothérapie (conjugaison de 5-FU et de LV) est administré dans certains cas à des patients de stade II à haut risque de récidive (Ribic et al., 2003; Cunningham et al., 2010). Les données de nombreuses études quant à la valeur prédictive du statut MMR pour la réponse à la chimiothérapie sont conflictuelles. Néanmoins, la plupart d’entre elles suggèrent une résistance au 5-FU et une inefficacité de traitement voire un effet délétère pour les patients atteints de CCR MSI dont la survie globale (ou OS pour Overall Survival) est réduite en comparaison aux patients MSS (Ribic et al., 2003; Sargent et al., 2010). Des études précliniques in vitro ont associé la résistance au 5-FU à la déficience du système MMR (Carethers et al., 1999; Meyers et al., 2001; Arnold, Goel and Boland, 2003). En effet, la chimio-sensibilité au 5-FU est dépendante des composants du système MMR, expliquant sa cytotoxicité réduite dans les cellules MSI (Tajima et al., 2004; Boland and Goel, 2010). Il est intéressant de noter qu’une analyse comparative intra-MSI discriminant les cas sporadiques des cas héréditaires a suggéré que l’amélioration de la survie sans récidive (ou DFS ou RFS pour Disease Free Survival et Relapse Free Survival respectivement) après traitement au 5-FU était restreinte aux patients suspectés d’être atteints de CCR associés au syndrome de Lynch sans amélioration de la DFS pour les patients atteints de CCR MSI sporadiques (Sinicrope et al., 2011).

En revanche, les cellules MMR-d sont sensibles à l’OXA (Fink et al., 1996) et le FOLFOX est le traitement standard des CCR de stade III après chirurgie de résection. Des études rétrospectives semblent indiquer une efficacité du FOLFOX sur les CCR MSI de stade III comparable à celle observée sur les CCR MSS de même stade c’est-à-dire que l’OS et la RFS

sont améliorées en comparaison aux patients non traités (Des Guetz et al., 2010; Zaanan et al., 2011; André et al., 2015; Tougeron et al., 2016; Kim et al., 2017). Ceci suggère une capacité de l’OXA à contrer l’effet néfaste de la thérapie de 5-FU dans les CCR MMR-d (Sinicrope et al., 2013; Tougeron et al., 2016).

Peu d’études ont été menées sur les CCR MSI métastatiques de stade IV en raison du très faible nombre de patients atteints. Une méta-analyse de sept études incorporant 964 patients de stade IV dont 91 MSI, révèle que le statut MMR-d ne paraît pas avoir de valeur prédictive sur l’effet de la chimiothérapie (Des Guetz et al., 2009). De plus, étant donné l’utilisation de chimiothérapies néo-adjuvantes et adjuvantes chez les patients de stade IV, le statut mutationnel de KRAS doit être pris en compte afin de guider la prise en charge thérapeutique (Goldstein et al., 2014; Stadler et al., 2016). Enfin, en ce qui concerne la valeur prédictive de l’administration d’irinotécan dans les tumeurs MSI, les données sont controversées. Une analyse rétrospective (1 264 patients de stade III dont 96 MSI) a montré une amélioration de la survie sans récidive des patients MSI traités avec du FOLFIRI comparé aux patients MSS (Bertagnolli et al., 2009). Toutefois, ces données n’ont pas été confirmées par l’étude PETACC-3 de 3 278 patients, une étude Coréenne de près de 300 patients et une étude anglaise (FOCUS) (Braun et al., 2008; Roth et al., 2010; Kim et al., 2011).

6.b. Thérapies ciblées : anticorps monoclonaux et immunothérapies anti-ICK

Les thérapies ciblées s’ajoutent à l’arsenal thérapeutique des CCR et peuvent être proposées en complément ou en alternative à la chimiothérapie. Actuellement, les anticorps monoclonaux anti-EGF-R et anti-VEGF sont donnés en routine aux patients ayant un CCR métastatique. Ils ont l’avantage de limiter les dommages causés aux cellules saines, d’être moins cytotoxiques que les chimiothérapies et d’avoir moins d’effets secondaires que ces dernières. L’émergence des immunothérapies bloquant les ICK constituent une nouvelle ligne de recherche de thérapeutiques pour les patients ayant des tumeurs solides. Ces deux types de thérapies ciblées sont décrits ci-dessous.

i. Anticorps monoclonaux anti-EGF-R et anti-VEGF

Les anticorps monoclonaux anti-cancéreux administrés en routine clinique sont utilisés seuls, en alternative ou en association avec la chimiothérapie (FOLFIRI ou FOLFOX) pour les CCR de stades IV métastatiques. Il existe deux types de médicaments ciblant les voies de signalisation activées par des facteurs de croissance et des facteurs d’angiogenèse.

Le cetuximab et le panitumumab ciblent le récepteur EGF-R (pour Epidermal Growth Factor Receptor) et inhibent les voies RAS/MAPK et PI3K/AKT promotrices de prolifération cellulaire, de survie et de croissance tumorale (Van Cutsem et al., 2009; Douillard et al., 2014). Les avancées de la recherche translationnelle et la stratification moléculaire des patients atteints de CCR permettent des thérapies basées sur des approches « omiques ». Notamment, le statut mutationnel de BRAF et KRAS des tumeurs des patients permet d’établir les résistances à ces anticorps (Allegra et al., 2009; Heinemann et al., 2009). Le bevacizumab est un anti-angiogénique ayant pour cible la voie VEGF (pour Vascular Endothelial Growth Factor) (Hurwitz et al., 2004).

Ces agents thérapeutiques améliorent la survie globale (jusqu’à 30 mois) des patients de stade IV (Cremolini et al., 2015). De façon intéressante, ces deux types d’anticorps semblent avoir des efficacités identiques, le bevacizumab offrant une stratégie thérapeutique alternative aux patients mutés KRAS résistants aux anti-EGF-R (Venook et al., 2017). Le statut MSI ne semble pas avoir de valeur prédictive sur ces traitements (Geißler et al., 2017) mais des études complémentaires sont nécessaires à la confirmation des données.

ii. Immunothérapies anti-ICK

Comme établi précédemment, les cancers MSI ont un phénotype hypermutateur qui induit la production massive de peptides néo-antigéniques. Ceci est suggéré comme étant la cause d’une forte immunoréactivité (infiltration dense de CTL CD8+) se traduisant par une inflammation importante (Maby, Galon and Latouche, 2016). De nouveaux mécanismes révélant les relations étroites liant les cellules tumorales et immunitaires du microenvironnement tumoral ont été mis en évidence, comme particulièrement le phénomène d’évasion immune par les cellules tumorales via l’expression de molécules

inhibitrices des lymphocytes, les ICK (PD-1, LAG-3, TIM-3, CTL-4, IDO), causant l’inactivation et l’épuisement des TILs (cf. supra : chapitre V.4) (Koido et al., 2013; Boissière-Michot et al., 2014; Llosa et al., 2015; Westdorp et al., 2016). Les avancées en immuno-oncologie ont permis le développement de nouvelles approches d’immunothérapie comme le recours à des inhibiteurs d’ICK qui permettraient l’abolition de la tolérance immune, notamment développée dans les cancers MSI et donc la réactivation fonctionnelle des TILs (figure 10).

Sur la base de ces approches, dans une étude de phase II, il a été montré que l’utilisation d’anticorps monoclonaux (mAb) PD-1/PD-L1 (pembrolizumab) activait l’immunité anti-tumorale et était bénéfique pour les patients atteints de cancers métastatiques MSI (CCR et autres, tels que carcinomes gastriques, de l’endomètre, du petit intestin, des voies biliaires (cholangiocarcinome) et de l’ampoule de Vater) (Le et al., 2015). Aucune réponse n’a été observée dans la cohorte de patients MSS de même stade. Une autre étude de phase II a obtenu des données similaires en utilisant le nivolumab (anti-PD-1 mAb) et/ou l’ipilimumab (anti-CTLA-4 mAb) (Overman et al., 2017). Récemment, ces résultats ont été validés dans des cancers métastatiques de douze types tumoraux différents (Le et al., 2017). Ces données laissent supposer la valeur prédictive positive du statut MSI pour la réponse aux immunothérapies anti-ICK. Ainsi, l’utilisation du pembrolizumab en clinique pour les cancers MMR-d métastatiques (CCR et autres) vient d’être approuvée par la FDA (pour Food Drugs and Administration) (Killock, 2017).

De manière intéressante, les CCR hypermutés non-MSI ayant pour origine des mutations somatiques du gène POLE présentent une charge néo-antigénique importante ainsi qu’une réponse immunitaire anti-tumorale conséquente (Domingo et al., 2016; Giannakis et al., 2016). Ils appartiennent également au groupe de tumeurs CMS1 (définies comme hypermutées avec une forte activation immune ; figure 7) (Cancer Genome Atlas, 2012; Guinney et al., 2015). L’expression importante des ICK PD-1, PD-L1 et CTLA-4 observée dans ces tumeurs fait de ces patients des candidats potentiels aux immunothérapies anti-ICK (Bourdais et al., 2017).

ARTICLE

THE DUAL ROLE OF GENOMIC INSTABILITY IN MISMATCH

REPAIR DEFICIENT COLORECTAL CANCER

V. Jonchère*, L. Marisa*, M. Greene* et al., soumis pour publication

Figure 12 │ Modèle proposé de progression tumorale MSI

Les cancers MSI sont caractérisés par la déficience du système MMR responsable d’une instabilité nucléotidique générale et d’avantage marquée au niveau des séquences répétées microsatellites. Notre étude a permis de mettre en évidence des évènements mutationnels sélectionnés (en rouge) au cours de la progression tumorale, dont les fréquences de mutation sont significativement plus importantes que le bruit de fond mutationnel lié à MSI, suggérant un rôle pro-oncogénique de ces mutations. Des évènements mutationnels potentiellement délétères pour les cellules tumorales semblent être contre-sélectionnés (en gris) dans les tumeurs MSI comme en attestent leurs fréquences de mutation significativement plus basses que le bruit de fond mutationnel lié à MSI.

FIGURE 12 │ Modèle proposé de progression tumorale MSI

Les cancers MSI sont caractérisés par la déficience du système MMR responsable d’une instabilité nucléotidique générale et d’avantage marquée au niveau des séquences répétées microsatellites. Notre étude a permis de mettre en évidence des évènements mutationnels sélectionnés (en rouge) au cours de la progression tumorale, dont les fréquences de mutation sont significativement plus importantes que le bruit de fond mutationnel lié à MSI (lui-même dépend de paramètres inhérents à la séquence répétée comme sa taille et sa nature en bases), suggérant un rôle pro-oncogénique de ces mutations. Des évènements mutationnels potentiellement délétères pour les cellules tumorale semblent être contre-sélectionnés (en gris) dans les tumeurs MSI comme en attestent leur fréquences de mutation significativement plus basses que le bruit de fond mutationnel lié à MSI.

M I C R O S A T E L L I T E S N O N R É P É T É E S I N S T A B I L I T É D E S S É Q U E N C E S P R O G R E S S I O N T U M O R A L E GCTATAAAAAAAATGGAC CGATATTTTTTTTATCTG HLA-DRB5 PIK3CA KRAS BRAF APC B2M RYR1 NOTCH1 PLXNA1 HMGXB4 PRRC2C GART WNK1 DOCK4 MFN2 ACVR2A IGF2R RNF43 TGFBR2 RUNX3 DCC BCL11B GCTATAAAAAAAATTGAC CGATATTTT-TTTAACTG

Résumé

Dans ce travail soumis pour publication, le rôle de l’instabilité génomique causée par un défaut du système MMR dans la tumorigenèse colorectale a été investigué. Pour cela, le séquençage d’exome (WES) de 47 tumeurs colorectales MSI a été réalisé. Leur mutanome a été analysé au niveau des séquences répétées (microsatellites) et non répétées génomiques, et de nouveaux modèles probabilistes ont été développés et appliqués pour mieux comprendre le contexte de leur survenue et de leur sélection dans ces cancers.

Nos résultats ont permis en particulier de pointer certains évènements mutationnels dont le taux de mutation est, dans le contexte MSI, significativement différent du « bruit de fond » mutationnel caractérisant ces tumeurs et dépendant de paramètres intrinsèques à la séquence répétée (taille, nature en bases). Nous avons ainsi pu identifier des microsatellites dont les mutations semblent positivement sélectionnées (N=1050), principalement au niveau de régions 5’ et 3’ UTRs (N=828), et de façon originale, des microsatellites dont les mutations semblent négativement sélectionnées (N=561, dont 548 au niveau de régions 5’ et 3’ UTRs et seulement 13 au niveau de microsatellites codants) au cours de la tumorigenèse. Ces résultats suggèrent un rôle pro- mais aussi anti- tumoral de l’instabilité génomique microsatellitaire (figure 12).

L’objectif de mon travail a été en particulier d’investiguer les phénomènes de contre-sélection de mutations codantes et de valider fonctionnellement l’impact délétère de celles-ci pour les cellules tumorales. J’ai ainsi analysé, dans des lignées cellulaires, la conséquence de l’inactivation de cinq gènes (WNK1, HMGXB4, RFC3, PRRC2C et GART) contenant un microsatellite A10 (10 adénines) dans leur région codante et dont la fréquence mutationnelle est significativement plus faible que celle liée au bruit de fond de mutations des cellules MMR déficientes. Mes résultats montrent que l’inhibition par siRNA de l’expression de ces gènes affaiblit considérablement la cellule tumorale. De plus, l’inactivation simultanée de plusieurs de ces gènes (associations de trois siRNA dirigés contre trois gènes : e.g. WNK1-HMGXB4-GART) a, en fonction des combinaisons, un effet délétère cumulatif sur la cellule cancéreuse soulignant l’importance du maintien à l’état sauvage de ces microsatellites dans la tumeur et validant l’hypothèse de la contre-sélection de certaines mutations somatiques générées du fait de MSI dans les cancers MMR-déficients. En outre, l’inhibition de deux de ces cibles (WNK1 et PRRC2C) induit une diminution de la croissance tumorale in vivo dans des modèles murins

de xénogreffes sous-cutanées (souris nude), confirmant leur caractère délétère dans un modèle pré-clinique d’étude classique en cancérologie.

THE DUAL ROLE OF GENOMIC INSTABILITY IN

MISMATCH REPAIR DEFICIENT COLORECTAL CANCER

Vincent Jonchère1,2,10, Laetitia Marisa1,2,10, Malorie Greene1,2,10, Alain Virouleau1,3, Olivier Buhard1, Romane Bertrand1, Magali Svrcek1,4, Pascale Cervera1,4, Anastasia Goloudina1,5, Erell Guillerm1,6, Florence Coulet1,6, Mira Ayadi2, Nabila Elarouci2, Lucile Armenoult2, Fatiha Merabtene1,7, Sylvie Dumont1,7, Yann Parc1,8, Jérémie Lefèvre1,8, Thierry André1,9, Jean-François Fléjou1,4, Agathe Guilloux3,11, Ada Collura1,11, Aurélien de Reyniès2,11, Alex Duval1,11,*

1 Sorbonne Université, UPMC UNIV Paris 06, INSERM, UMR-938, Equipe Instabilité des Microsatellites et Cancer, Centre de Recherche Saint-Antoine, F-75012 Paris, France. Équipe labellisée par la Ligue Contre le Cancer.

2 Programme Cartes d'Identité des Tumeurs (CIT), Ligue Nationale Contre Le Cancer, Paris, 75013, France.

3 LAMME, Univ Evry, CNRS, Université Paris-Saclay, Évry, 91025, France.

4 AP-HP, Hôpital Saint-Antoine, Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, Paris, France.

5 Inovarion F-75013 Paris, France.

6 AP-HP, Pitié Salpêtrière Hôpital, Genetics Department, Paris, 75013, France. 7 Sorbonne Université, UPMC Paris 06, UMS-30 LUMIC, Plateforme

d’Histomorphologie, Saint-Antoine F-75012 Paris, France.

8 AP-HP, Hôpital Saint-Antoine, Service de Chirurgie Générale et Digestive, Paris, France.

9 AP-HP, Department of Oncology, Hôpital Saint-Antoine, Paris, 75012, France. 10 Co-first authors

11 Co-last authors

KEYWORDS

Colorectal cancer; Mismatch repair deficiency; Genetic instability; repetitive and non-repetitive DNA sequences; Probabilistic model; Somatic mutations; Driver mutations; Selection pressure; Tumor evolution; Functional validation.

HIGHLIGHTS

 Positive and negative selection of microsatellite mutations is observed in MMR-deficient CRC.

 These mutations have contradictory effects in multiple pathways underlying colon tumorigenesis.

 These mutations combine with other events in non-repetitive sequences to allow CRC progression.

 These results define a new model of cancer progression based upon pro- and anti-cancer driver events.

SUMMARY

Genomic instability favors the acquisition of somatic mutations, which then confer selective advantages to clonal expansion during tumor progression. In cancers that harbor high levels of genomic instability, we hypothesized this feature could also produce frequent mutations that may be neutral or even deleterious to tumorigenesis, thus complicating the above paradigm. We performed whole exome sequencing on 47 mismatch repair (MMR) deficient colorectal cancers (CRC). The development of probability models, together with functional experiments in CRC cell lines, identified mutations that were positively or negatively selected in tumor DNA and highlight their oncogenic or anticancer effect, respectively. Our findings demonstrate a dual role for genomic instability in MMR-deficient CRC, thus opening up new pathophysiological and therapeutic avenues in these tumors.

SIGNIFICANCE

Genomic instability is generally admitted as a process that leads to the generation of mutations conferring a selective advantage to the cell in which they occur, thus allowing their outgrowth and putative dominance in the bulk of the tumor. In a subset of frequent cancers that harbor high levels of genomic instability, namely the MSI tumors, we here demonstrate this process has a dual role, also producing frequent mutations that are disadvantageous to tumorigenesis. The demonstration of opposing functional roles for genomic instability calls into question the repertoire of key genomic events in the MSI-driven tumorigenic process. It may explain important features of MSI tumors, such as their improved prognosis and their weakly invasive and yet metastatic properties.

INTRODUCTION

Cancer is generally accepted to be the result of a complex process involving many genes that participate in various biological activities. Acquisition of the multiple hallmarks of cancer is mainly due to somatic mutations in these candidate genes, resulting in the deregulation of signaling pathways involved in tumor initiation or progression. These hallmarks are a convenient organizing principle to rationalize the growth and complexity of tumors. They include sustained proliferative signaling, evasion of growth suppressors, resistance to cell death, enabling of replicative immortality, induction of angiogenesis, activation of invasion and metastasis, reprogramming of energy metabolism, and evasion from immune destruction (for review, see (Hanahan and Weinberg, 2011)). Underlying these mutations is the characteristic of genomic instability. This feature creates the diversity that favors acquisition of cancer hallmarks by the tumor cells, with consequences also for the recruitment of a repertoire of likely normal cells that constitute the tumor microenvironment. Simply depicted, genomic instability leads to the generation of certain mutant genotypes that confer selective advantages to the cells in which they occur, allowing these cells to reach dominance in the bulk of the tumor (Greaves and Maley, 2012). Different types of genomic instability have been described thus far in human malignancies, which give rise to numerous genetic changes at the chromosomal or nucleotide levels. One particular subset of cancers is characterized by inactivating alterations of mismatch repair (MMR) genes (Fishel et al., 1993; Ionov et al., 1993; Leach et al., 1993; Thibodeau et al., 1993). In these tumors, MMR-deficiency results in the inability to recognize and repair errors that occur naturally during DNA replication. As a consequence, they exhibit a distinctive phenotype called MSI (for Microsatellite Instability), alternatively known as the mutator phenotype, which

is characterized by a high level of global instability at the nucleotide level. MSI affects thousands of microsatellite DNA sequences, while numerous alterations are also