1. Généralités sur le stage
3.4. Matériel et méthodes
3.4.3 Méthodes
Echantillonnage
Une enquête séro-épidémiologique a été réalisée entre octobre 2016 et décembre 2017 dans deux régions du Bénin pour évaluer le niveau d’infection des ovins et caprins par T.gondii, agent étiologique de la toxoplasmose. Pour l'échantillonnage, une taille minimale de 97 a été calculée par espèce selon la formule n= Z2 X P (1-p)/d2, afin d'estimer la prévalence avec au moins d= 10% de précision, P=50% de prévalence attendue dans un intervalle de confiance Z=
95% selon Thrusfield (2005). Dans un premier temps, 153 échantillons de chèvres ont été prélevés en élevage familial au niveau de 31 ménages dans trois communes du Sud-Bénin. Il s’agissait entre autres des animaux élevés en élevage familial qui évoluent à proximité des cases. Ces derniers partagent la plupart du temps le même environnement que l’homme et les chats. En plus de ces échantillons, 215 ovins sahéliens élevés en système d’élevage extensif dans deux zones agro-écologique de l’extrême Nord-Bénin où règne un climat sec toute l’année (température >35°C) ont été prélevés à l’abattoir de Cotonou portant le nombre d’échantillons collectés à 368.
Méthodes de collecte des échantillons de sang
Sur chaque animal vivant, choisi dans les ménages ou à l’abattoir, environ 5 ml de sang ont été prélevés au niveau de la veine jugulaire. Le sang est collecté dans des tubes secs puis ramené au laboratoire dans des glacières munie de carboglace. Après centrifugation à 3500 tours/min pendant 5min, les sérums de chaque tube ont été transférés dans deux tubes eppendorf, marqués de l’identifiant de chaque animal et stockés à -20°C au congélateur jusqu’à la réalisation des tests sérologiques. Par ailleurs, chaque prélèvement a été accompagné d’un questionnaire renseignant sur la situation géographique de la zone de prélèvement, l’âge, le sexe, la race de l’animal, la présence de chats dans les ménages et le lieu de provenance de l’animal pour les ovins. Ces données ont été utilisées pour identifier les facteurs de risque influençant l’infection des animaux étudiés par Toxoplasma gondii.
Analyses sérologiques
Les anticorps IgG dirigés contre T. gondii dans les sérums ont été détectés au Laboratoire de Diagnostic vétérinaire et de Séro-surveillance de Parakou (LADISERO) par la méthode ELISA indirect utilisant l’antigène P30 spécifique de Toxoplasma gondii à l’aide des Kits « ID Screen Toxoplasmosis MultispeciesR » de Innovative Diagnostic, Montpellier, France selon les instructions du fabricant.
o Principe du test
Des cupules sont sensibilisées avec l’antigène P30 spécifique de Toxoplasma gondii.
Les échantillons à tester et les contrôles sont distribués dans les cupules. Les anticorps spécifiques de Toxoplasma, s’ils sont présents, forment un complexe antigène-anticorps. Après lavage, un conjugué anti-multi-espèces marqué à la peroxydase (HRP) est distribué dans les cupules. Il se fixe aux anticorps, formant un complexe antigène-anticorps-conjugué-HRP.
Après élimination du conjugué en excès par lavage, la réaction est révélée par une solution de révélation (TMB). La coloration qui en résulte est liée à la quantité d’anticorps spécifiques présents dans l’échantillon à tester:
- En présence d’anticorps dans l’échantillon, il apparaît une coloration bleue qui devient jaune après blocage.
- En absence d’anticorps dans l’échantillon, il n’apparaît pas de coloration. La lecture est réalisée à 450 nm.
o Mode Opératoire
Pour la manipulation, les réactifs ont été ramenés à température ambiante (27°C ± 5°C) et ont été homogénéisés avant leur utilisation. Une dilution au 1 /10 des sérums de porcs et des témoins négatifs et positifs fournis dans le kit a été effectuée puis les échantillons ont été distribués dans les cupules selon le mode opératoire décrit ci-dessous :
1. Distribuer 90 µl de Tampon de dilution 2 dans chaque puits.
2. Distribuer:
- 10 µl de Contrôle Négatif dans les cupules A1 et B1.
- 10 µl de Contrôle Positif dans les cupules C1 et D1.
- 10 µl de chaque échantillon à tester dans les cupules restantes.
3. Incuber 45 min ±4 min à 21°C (±5°C).
4. Laver 3 fois chaque cupule avec environ 300 µl de Solution de lavage. Eviter le dessèchement des cupules entre les lavages.
5. Préparer le Conjugué 1X en diluant le Conjugué 10X au 1/10ème en Tampon de dilution 3.
6. Distribuer 100 µl de Conjugué 1x dans chaque cupule.
7. Incuber 30 min ±3 min à 21°C (±5°C).
8. Laver 3 fois chaque cupule avec environ 300 µl de solution de lavage.
9. Distribuer 100 µl de Solution de révélation dans chaque cupule.
10. Incuber 15 min ±2 min à 21°C (±5°C) à l’obscurité.
11. Distribuer 100 µl de Solution d’arrêt dans chaque cupule pour arrêter la réaction.
12. Mesurer et enregistrer les densités optiques à 450 nm au spectrophotomètre.
o Interprétation des résultats
Pour l'interprétation des résultats, le pourcentage S/P (S : Sample ; P : Positive control) a été calculé avec la formule suivante : S/P % = (DO de l'échantillon / DO du témoin positif) x 100. Si S/P est inférieur ou égal à 40%, le résultat est considéré comme négatif ; si S/P est compris entre 40% et 50%, le résultat est considéré comme douteux; si S/P est supérieur ou égal à 50% et inférieur à 200%, le résultat est considéré comme positif ; si S/P est supérieur ou égal à 200%, le résultat est fortement positif. Le test est validé si la valeur moyenne de la DO du témoin positif est supérieure à 0,350 (DO>0,350) et si le rapport entre la moyenne des DO des contrôles positifs (DOcp) et la moyenne des DO des contrôles négatifs (DOcn) est supérieure à 3,5.
Analyses statistiques des données
La prévalence de la toxoplasmose a été calculée selon la formule P=np/N où np représente le nombre de positif et N la taille de l’échantillon. Pour chaque facteur de variation, les Odd-Ratios, ainsi que les intervalles de confiance à 95% ont été calculés et la comparaison des prévalences entre les différentes modalités a été effectuée en utilisant le Test de khi-carré ou le test exact de Fischer à l’aide du logiciel Epi-Info 7 (Epi-InfoTM CDC, USA).