Les tests indirects révèlent la réponse de l’hôte à l’infection par Map, et ciblent soit l’immunité cellulaire, soit l’immunité anticorps (paragraphe 1.2.3). Un résultat positif à l’un de ces tests ne renseigne donc pas sur la capacité de contamination du milieu exté- rieur par l’animal mais permet d’identifier les animaux qui ont été au contact de Map et qui sont potentiellement infectés voire excréteurs.
3.2.1 Méthodes basées sur la détection de l’immunité cellulaire
Deux tests ciblant l’immunité cellulaire peuvent être utilisés pour le diagnostic de la paratuberculose en élevage : l’intradermotuberculination (IDT) et le dosage d’IFNγ après stimulation sanguine.
Intradermotuberculination. Ces tests consistent à injecter une solution antigénique par voie intradermique puis à mesurer l’augmentation du pli de peau au site de l’injection 72 heures après injection, révélant ainsi une hypersensibilité retardée de type IV. Cette fa- mille de tests, développée originellement pour le diagnostic de la tuberculose humaine a ensuite été adaptée pour la recherche de la paratuberculose chez les bovins ainsi que chez les ovins (Robbe-Austerman, 2007). Dans le cadre du diagnostic de Map, l’allergène uti- lisé est la johnine (un dérivé de protéine purifié), obtenu après chauffage du milieu ayant servi à la culture de la mycobactérie. Tout comme pour le diagnostic de la tuberculose, l’injection de johnine provoque une période d’anergie de six semaines durant laquelle l’animal ne pourra être détecté par intradermotuberculination.
3. TESTS POUR LE DIAGNOSTIC INDIVIDUEL DE LA PARATUBERCULOSE Stimulation antigénique et dosage d’IFNγ. Le dosage de l’IFNγ, consiste à stimuler un prélèvement sanguin à l’aide de dérivés de protéines purifiées. Les lymphocytes circu- lant, s’ils sont présents, reconnaissent les antigènes spécifiques de Map et secrétent alors de l’IFNγ qui est ensuite dosé à l’aide d’un test ELISA (Rothel et al., 1990). La réalisation d’un test IFNγ présente certains inconvénients tels que un coût élevé, une valeur prédic- tive positive faible ainsi qu’un délai très court (moins d’une demi-journée) entre prélè- vement et stimulation antigénique. Pour surmonter ce dernier problème, Jungersen et al. (2012) ont évalué la possibilité de réaliser un test IFNγ 24 heures après le prélèvement, en complémentant ce dernier avec des interleukines (IL-2 et IL-12). L’ajout d’ IL-2, bien qu’assurant la détection de l’INFγ 24 heures après le prélèvement, dégradait fortement la spécificité contrairement au protocole avec complémentation en IL-12.
3.2.2 Tests basés sur la mesure de l’immunité anticorps
Ces tests sont basés sur la détection d’une réponse anticorps chez des animaux infec- tés par Map, qu’ils soient excréteurs ou non.
Test d’immunodiffusion en gélose (AGID). Le test AGID est réalisé par migration entre des puits percés dans une gélose d’agar d’une part d’antigènes de Map et d’autre part du sérum de l’animal à tester. Après une incubation de 24 à 48 heures, le test est considéré positif s’il y a apparition d’une ligne de précipitation entre le puits contenant l’antigène et le puits contenant le sérum à tester. Ce test n’est plus utilisé en routine.
Test de fixation du complément. Le test de fixation du complément se réalise à par- tir de sérum ayant une concentration standardisée de protéines du complément. Cette étape est réalisée par dénaturation des protéines du complément puis ajout d’une quan- tité standardisée de complément. Cela est possible car les protéines du complément sont moins résistantes à la chaleur que les anticorps. L’antigène est ensuite ajouté au sérum normalisé. Si des anticorps contre Map sont présents les protéines du complément vont être consommées. On ajoute ensuite un complexe immun formé de globules rouges et d’anticorps. Si les protéines du complément n’ont pas été consommées, elles provoquent la lyse des globules rouges donnant au sérum une coloration rouge. Si le sérum contient
des anticorps dirigés contre l’antigène recherché, il demeurera incolore. De même, ce test n’est plus utilisé en routine.
ELISA indirect. Les deux tests décrits précédemment ont progressivement été rempla- cés par des tests ELISA indirects. Le principe du test ELISA repose sur la formation et la détection de complexes immuns. Une première étape de préabsorption permet de fixer les anticorps dirigés contre d’autres mycobactéries et idéalement, de limiter les réactions croisées. Le sérum à tester est ensuite placé dans un puits au fond duquel sont fixés des antigènes de Map. Les anticorps du sérum se fixent sur les antigènes et le reste du sérum est éliminé par lavage. Un conjugué (composé à forte affinité pour les anticorps) couplé à une enzyme est ensuite ajouté dans le puits. Le reste du conjugué est éliminé par lavage et le substrat de l’enzyme est ajouté dans le puits. Si des anticorps sont présents dans le sérum testé, il y a alors, formation de complexes antigènes – anticorps – conjugué – enzyme. L’enzyme dégrade alors le substrat ce qui produit une réaction colorée dont l’in- tensité est proportionnelle à la quantité d’anticorps dirigés contre Map présents dans le sérum. Le résultat d’un test ELISA peu être quantifié par le calcul du ratio entre l’intensité de réaction de l’échantillon et celle du contrôle positif (Sample to positive ratio; S/P). En l’absence d’anticorps dirigés contre Map dans l’échantillon testé le substrat n’est pas dé- gradé. Dans le cas de la paratuberculose, les tests ELISA peuvent être réalisés à partir d’un échantillon de sérum, de plasma, ou de lait.
En France, cinq kits ELISA indirects commerciaux sont actuellement disponibles : — IDEXX Paratuberculosis Screening Ab Test
— ID Screen Paratuberculosis Indirect – IDVet
— SERELISA®M. ParaTB Ab Mono Indirect dévellopé par Symbotics et désormais com- mercialisé par Zoetis
— LSIVet Ruminant Paratuberculosis Advanced Serum ELISA commercialisé par Thermo- Fisher
— PARACHEK®2 (Prionics) commercialisé par Thermo-Fisher
Ils se différencient par les antigènes de Map utilisés dont la nature n’est pas communi- quée par les fabricants.
3. TESTS POUR LE DIAGNOSTIC INDIVIDUEL DE LA PARATUBERCULOSE Évaluation de la réponse immunitaire. L’évaluation des profils cytokiniques peut être considérée comme une extension du dosage de l’IFNγ. La possibilité d’identifier les ani- maux infectés par Map en mesurant les concentrations plasmatiques de différentes cyto- kines ou des niveaux d’expression des gènes associés a fait l’objet de plusieurs études. Lee et al. (2001) ont comparé les niveaux d’expression des gènes codant pour six cytokines dif- férentes (IL-1α, IL-1β, IL-6, IFNγ, TNF α et β-Actin) dans l’iléon de sept bovins en phase clinique de la maladie et de huit bovins indemnes. Les résultats indiquent une expres- sion augmentée des gènes codant pour l’IL-1α, l’IL-1β, l’IL-6, et l’IFNγ) chez les bovins cliniquement affectés. Pour améliorer le potentiel diagnostique des profils cytokiniques, Coussens et al. (2004) ont comparé les niveaux d’expression, avec ou sans stimulation préalable par Map, des gènes codant pour 10 cytokines dans les cellules sanguines mono- nuclées, l’iléon et les noeuds lymphatiques mésentériques chez quatre bovins indemnes, six infectés, et quatre en phase clinique. Dans les cellules sanguines mononuclées, des différences significatives de niveaux d’expression des gènes codant pour l’IFNγ, le TGF-β, TNF-α, l’IL-1α, l’IL-4, l’IL-6, l’IL-8, and l’IL-12p35 ont pu être mises en évidence entre les bovins indemnes et les bovins infectés et/ou en phase clinique et ceci sans stimulation préalable par Map. Après stimulation le gène codant pour IL-10 avait aussi des niveaux d’expression supérieurs chez les animaux infectés.
Peu d’études sont disponibles sur les niveaux d’expression mesurés à partir de prélè- vements sanguins chez les ovins de plusieurs cytokines. Une augmentation significative et durable des concentrations en IL-10 a été mise en évidence entre des ovins inoculés par voie orale et le groupe témoins, dès quatre mois post-infection (de Silva et al., 2011).
Les études menées chez les ovins se sont concentrées sur les différentes formes lésion- nelles de la maladie (paucibacillaire ou multibacillaire). Smeed et al. (2007) ont étudié le profil cytokinique à partir de prélèvements d’iléon de 10 ovins avec la forme multiba- cillaires, 10 pour le type paucibacillaires et 10 animaux sans signes cliniques. Les pro- fils d’expression de gènes entre les groupes d’animaux sont apparus différents, comme le montre la figure 10. Des différences du niveau d’expression des gènes codant pour TNF-α sont aussi retrouvées à plusieurs reprises chez les ovins (Alzuherri et al., 1996 ; Rossi et al., 2009). En revanche, l’IL-1α, cytokine identifiée à plusieurs reprises avec une expression
différente chez les bovins infectés ou non infectés ne semble pas retrouvée chez les ovins.
FIGURE10 – Variation d’expression de gènes codant pour différentes cytokines en relation avec différentes formes de la maladie chez les ovins (Smeed et al., 2007)
(a) paucibacillaires versus asymptomatiques; (b) multibacillaires versus asymptomatiques; (c) paucibacillaires versus multibacillaires. Les résultats sont exprimés en facteur de multiplication du nombre moyen de copies des gènes évalués par PCR dans le premier groupe par rapport au second. Tous les résultats présentés sont significatifs (p≤0,05)
* retrait d’une valeur aberrante.
L’évaluation des profils cytokiniques pourrait ainsi servir de support à un test de dé- pistage précoce de l’infection par Map. En évaluant le type de réponse immunitaire pré- sent chez l’animal, le pronostic d’évolution (résolution, installation de l’infection) pour- rait par ailleurs en être déduit (de Silva et al., 2013 ; Khare et al., 2016). A l’heure actuelle ce test n’est pas applicable en pratique, pour des raisons de coût, de lourdeur de mise en oeuvre, du manque de valeurs de référence et d’absence d’évaluation des performances diagnostiques associées.
3. TESTS POUR LE DIAGNOSTIC INDIVIDUEL DE LA PARATUBERCULOSE
Tableau 1 – Synthèse des méthodes les plus utilisées pour diagnostic ou le dépistage de la paratu- berculose
Test Durée d’analyse Sensibilité analytique sang lait fèces tissu Directes
Ziehl-Nieelsen jour ND ND - -
Culture mois - + ++ ++
PCR jour - + +++ +++
phage assay heures +++ +++ ND ND
Indirectes
IDT jours ND ND ND ND
ELISA heure/jour + + ND ND
IFN heure +++ ND ND ND
4 Performances diagnostiques des tests biologiques
L’utilisation d’un examen complémentaire sur un animal, ou sur un groupe d’ani- maux, a pour objectif d’obtenir une information sur le statut sanitaire de cet animal ou de ce groupe; celle ci peut être de nature qualitative ou quantitative. En suivant la définition de Toma et al. (2010), deux objectifs peuvent être recherchés lors de l’utilisation d’un test : — diagnostic : l’application d’un examen de laboratoire vise à confirmer ou infirmer
la présence d’une maladie chez un sujet qui présente des troubles de la santé. — dépistage : l’application d’un examen de laboratoire vise à la recherche systéma-
tique, dans une population, des individus (ou des groupes) atteints par un trouble de la santé donné, passé jusque-là inaperçu.
Les tests peuvent détecter l’agent pathogène et sont alors qualifiés de directs. La po- sitivité d’un test direct renseigne donc sur la présence de l’agent pathogène chez l’ani- mal contrairement aux tests indirects, qui permettent de révéler la présence de différents marqueurs induits chez l’hôte par l’infection. L’information obtenue par un test indirect ne renseigne donc pas nécessairement sur la présence de l’agent pathogène au moment du prélèvement. Le résultat d’un test, qu’il soit direct ou indirect, n’implique donc pas de façon certaine l’infection de l’animal par l’agent pathogène recherché au moment où le test est réalisé.