2.1.1 Matériels et méthodes
Six ovins ont été sélectionnés sur la base de leurs résultats de qPCR individuelle (ta- bleau 5). Ces animaux ont été suivis sur le site de l’ENVT, en cases individuelles, afin de réaliser des prélèvements de fèces durant deux semaines. Des sachets journaliers de fèces ont été constitués et identifiés pour chaque animal. Un sachet contenant plus de 300g de fèces a été sélectionné pour chaque animal et huit analyses de qPCR, quatre à partir d’une prise d’échantillon de trois grammes et quatre à partir d’une prise d’échan- tillon de 10 grammes, ont été réalisées. Le protocole de qPCR appliqué est celui de la trousse ADIAVET™ paraTB Real Time, BioX. Deux extractions d’ADN ont été réalisées pour chaque point et l’amplification a été réalisée deux fois, afin d’évaluer la variabilité inter- et intra-plaque.
Cette étape d’analyse individuelle nous a permis de connaître précisément le niveau d’ex- crétion individuel correspondant aux sachets de fèces sélectionnés avant d’entreprendre l’analyse de mélanges d’échantillons. Nous avons réalisé des dilutions de ces fèces posi- tives en utilisant des fèces négatives provenant d’un élevage expérimental de brebis La- caune indemne de paratuberculose (troupeau INRA de La Fage).
Le plan d’analyse est présenté à la figure 18. Chaque sachet a été testé en qPCR en fonction de deux prises initiales de fèces différentes (3 et 10 grammes) correspondant aux extremums fournis par le fabricant de la trousse de qPCR. Trois tailles de mélanges (5, 10 et 20) ont été évaluées. Chaque mélange a été réalisé à partir d’une prise initiale d’un sachet d’un des animaux infectés, complétée avec des fèces négatives et suivi d’une ho- mogénéisation manuelle effectuée dans un sachet plastique pendant une à deux minutes.
FIGURE18 – Plan d’analyse pour l’analyse de la SeDde la qPCR en mélange de fèces
Le plan d’analyse est construit en fonction de la prise initiale dans le sachet de fèces.
A) Neuf prises de 10 g ont été effectuées, trois permettant de faire des mélanges de cinq animaux par ajout de 40 g de fèces négatives, trois pour des mélanges de taille 10, par ajout de 90 g de fèces négatives et trois pour des mélanges de taille 20 par ajout de 210 g de fèces négatives. Chaque mélange (15 au total) a été extrait et amplifié cinq fois à partir d’une prise de 10 g.
B) Vingt-cinq prises de trois g ont été effectuées, 15 permettant de faire des mélanges de cinq animaux par ajout de 12 g de fèces négatives, cinq pour des mélanges de taille 10 par ajout de 27 g de fèces négatives et cinq pour des mélanges de taille 20 par ajout de 57 g de fèces négatives. Pour chaque taille de mélange, 15 extractions et amplifications ont été réalisées à partir de 10 g.
2.1.2 Résultats
Les résultats des analyses individuelles sont présentés dans la figure 19. Les variations inter-plaques ont été évaluées en calculant le coefficient de variation (CV) défini par le rapport entre l’écart type des valeurs de Ct et la moyenne des valeurs de Ct. Le CV a tout d’abord été calculé entre les deux plaques d’amplification à partir des échantillons indivi- duels afin de s’assurer de la répétabilité de la méthode de qPCR (préparation des échan- tillons, extraction et amplification). Pour chaque animal ce coefficient a été comparé en
2. COMPLÉMENTS : ANALYSES DE MÉLANGES D’ÉCHANTILLONS
Tableau 5 – Résultats de l’analyse qPCR sur fèces des animaux choisis pour l’évaluation de la sen- sibilité de la qPCR ADIAVET™paraTB Real Time (BioX) appliquée à des mélanges de fèces.
ID Ct moyen Ct minimum Ct maximum
1 39.3 35.3 Négatif 2 35,8 34,1 39,6 3 23,0 20,5 25,0 4 20,0 19,2 22,2 5 20,9 18,0 23,2 6 26,7 26,2 27,7
Liste des animaux prélevés afin de déterminer la SeDrelative de la qPCR sur mélange de fèces.
Le Ct présenté est la moyenne des Ct des huit analyses individuelles réalisées avant les analyses en mélanges
fonction de la prise initiale de fèces.
Nous n’avons pas observé de différences du CV entre les prises de 3 g (minimum : 0,05%, moyenne : 4,11%, maximum :13,77%) et de 10 g (minimum : 0,18%, moyenne : 3,55%, maximum :13,73%) ni de relation entre la valeur du Ct et le CV. Ces résultats nous permettent de conclure à une bonne répétabilité de l’analyse qPCR. Le même travail a été effectué pour évaluer la variation de la valeur de Ct intra-plaque entre les différentes prises d’échantillons provenant d’un même sachet. A l’exception de deux points de qPCR, toutes les valeurs de CV étaient inférieures à 10%.
Les résultats observés dans la figure 19 sont en accord avec les différences de niveau d’excrétion individuel. La valeur de Ct théorique a été calculée en appliquant la relation définie par l’équation (1) présentée au chapitre 1. En utilisant le seuil de positivité de Ct≤42, tous les mélanges contenant des fèces d’animaux forts excréteurs étaient positifs, et un seul mélange était considéré comme négatif en abaissant le seuil de positivité de deux cycles (Ct≤40).
Pour les mélanges contenant un échantillon dont la valeur de Ct individuelle était élevée (brebis 1 ou 2), les résultats sont apparus plus variables et peuvent refléter une mauvaise homogénéisation des mélanges de fèces.
FIGURE19 – Résultats des analyses de qPCR sur des mélanges de fèces
Chaque mélange analysé est représenté par un point bleu ou rouge.
Pour chaque taille, les mélanges d’une brebis sont groupés autour du Ct théorique représenté par un point vert. Les points bleus sont les mélanges réalisés à partir de 3 g de fèces, les points rouges sont ceux réalisés à partir de 10 g de fèces.
Le panel de haut de la figure regroupe les résultats des quatre animaux forts excréteurs, celui du bas ceux des animaux faibles excréteurs.
Les seuils de positivité de la qPCR sont représentés par deux lignes horizontales en pointillées. En noir, le seuil de Ct=40 recommandé par le fabricant, en gris le seuil de Ct=42 calculé comme le seuil maximum de détection.