Ces méthodes reposent sur l’utilisation d’un anticorps spécifique de la molécule à doser.
Elles présentent le gros avantage d’être rapides car entièrement automatisables et ne nécessitant pas de phase préliminaire d’extraction. Le résultat peut donc être obtenu rapidement dans les cas de surdosage. Leur spécificité et leur sensibilité sont bonnes.
Par contre, seules les molécules pour lesquelles un kit de dosage est commercialisé peuvent être dosées par cette méthode. Ces méthodes ne permettent pas le dosage des métabolites, qui peuvent dans certains cas être actifs et participer à l’activité pharmacologique, à l’origine parfois de discordance entre concentration plasmatique et effet clinique.
Principe générale :
Les méthodes immunochimiques utilisent un anticorps spécifique de la molécule à doser ainsi qu’une forme marquée de ce même composé. La mise en présence d’une quantité connue d’anticorps, de molécule spécifique marquée et d’une quantité inconnue de molécules à doser provenant d’un échantillon, va entraîner la formation de deux types de complexes antigène-anticorps entrant en compétition, l’un avec la molécule marquée, l’autre avec la molécule à doser. Le nombre de molécules marquées se fixant à l’anticorps est inversement
proportionnelle au nombre de molécules non marquées initialement présentes dans l’échantillon à doser. Il existe ensuite deux méthodes principales de quantification de la réaction : les méthodes en phase homogène et les méthodes en phase hétérogène
1. Méthodes par compétition en phase homogène
Marqueurs enzymatiques :
EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technic) :
La technique EMIT est basée sur l’activité enzymatique d’une enzyme marquée au médicament, la glucose-6- phosphate déshydrogénase (PDH), modulée par des anticorps dirigés contre le médicament. L’activité enzymatique (en présence de glucose-6-phosphate) entraîne la conversion de la nicotine adénine dinucléotide (NAD) en la forme réduite NADH et l’augmentation subséquente de l’absorbance à 340 nm est surveillée par spectrophotométrie. L’addition de l’anticorps anti-médicament entraîne la liaison à l’enzyme marquée par le médicament, ce qui réduit efficacement l’activité enzymatique. Tout médicament dans l’échantillon entre en compétition avec l’enzyme marquée par le médicament en se liant à l’anticorps, ce qui permet à l’enzyme non liée de devenir active et augmente ainsi l’absorbance à 340 nm. Par conséquent, des quantités croissantes de médicament dans l’échantillon produisent une activité enzymatique accrue et donc une augmentation de la vitesse de variation de l’absorbance à 340 nm.
CEDIA (Cloned Enzyme Immuno Donor Assay):
Ce système, comme EMIT, utilise la liaison d’un anticorps pour influencer l’activité d’une enzyme. La compétition pour la liaison par médicament présent dans l’échantillon entraîne une augmentation de l’activité enzymatique.
Le principe CEDIA repose sur la complémentation spontanée de deux fragments génétiquement modifiés de bêta-galactosidase d’Escherichia coli. La chaîne polypeptidique de l’enzyme est présentée sous forme de deux fragments inactifs, le grand fragment, appelé accepteur d’enzyme (EA), et un petit fragment, donneur d’enzyme (ED), qui contient les 5% d’enzyme manquants dans la partie EA. En conjuguant l’haptène au fragment ED, l’addition d’anticorps qui lient l’haptène peut empêcher la formation d’une enzyme intacte et donc active. Tout médicament présent dans l’échantillon entre en compétition pour des sites de liaison d’anticorps, de sorte qu’une augmentation des concentrations de médicament donne moins de liaison d’anticorps au fragment ED et résulte donc en plus d’activité enzymatique qui peut être surveillée par spectrophotométrie.
Marqueurs fluorescents :
FPIA (Fluorescence Polarization Immuno Assay) :
Le marquage de la molécule est réalisé par la fluorescéine comme molécule traceur. La révélation du complexe antigène-anticorps est basée sur la différence de rotation de la lumière induite par la forme libre ou liée de la molécule marquée.
L’antigène marqué à la fluorescéine tourne rapidement lorsqu’il n’est pas lié par un anticorps. Lorsque lié par l’anticorps, la rotation est considérablement ralentie par rapport à la molécule non liée. Pour générer le signal de dosage, un fluorimètre fait briller la lumière, à la longueur d’onde d’excitation de la fluorescéine, à travers un filtre polarisant vertical. Les molécules de fluorescéine non liées et à rotation rapide émettent de la lumière dans un plan différent de la lumière incidente, tandis que la fluorescéine liée à l’anticorps relativement stationnaire renvoie la lumière dans un plan similaire, qui est détecté par le filtre polarisant.
Le médicament ajouté par l’intermédiaire de l’échantillon entre en compétition avec l’anticorps marqué à la fluorescéine, réduisant ainsi la quantité de fluorescéine liée à l’anticorps, ce qui entraîne la détection d’une moindre fluorescence émise par le biais du filtre polarisé. La fluorescence de fond trouvée avec de nombreux échantillons biologiques signifie qu’il est habituel de faire une lecture à blanc de l’échantillon et des réactifs avant l’addition du traceur fluorescent au mélange.
Figure 21: Principe et mesure par la méthode FPIA (peu de substance à doser)[101].
2. Méthodes par compétition en phase hétérogène :
ELISA : (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay).
Un anticorps anti-médicament est adsorbé sur une phase solide, et l'antigène (médicament à doser) est ajouté, puis révélé par un second anticorps couplé à une enzyme. La peroxydase ou la phosphatase sont les plus largement utilisées. On ajoute un substrat chromogène qui est dégradé par l'enzyme en un produit coloré. L’absorbance dans chaque puits est lue à une longueur d'onde double (450/630 nm). Le développement de la couleur est inversement proportionnel à la quantité du médicament présente dans l’échantillon. Les concentrations sont interposées à partir d'une courbe d’étalonnage.