1/ Méthodes de travail et techniques utilisées

 Préparation de la solution mère :

Une masse de 100 mg d'extrait a été dissoute dans 1 ml d'eau distillée stérile pour les extraits méthanolique et aqueux, et dans 1 ml de DMSO pour les extraits hexanique et l'extrait de dichlorométhane.

 Préparation des suspensions :

Les suspensions de différentes souches ont été préparées à partir de cultures âgées de 48h et incubées à 37°C sur un milieu Sabouraud. Une colonie a été grattée à l’aide d’une anse stérile puis elle a été immergée dans un tube contenant 9 ml d’eau physiologique stérile.

 Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) :

Pour la détermination des CMI, la méthode utilisée est celle de la microtitration. Cette méthode consiste à employer des microplaques stériles de 96 puits à fond plat (Bio-Rad). Concernant le test de l’activité antifongique des extraits d’Artemisia mésatlantica, on a pris un volume de 100 µl de bouillon de Sabouraud a été déposé dans les 87 puits, 100 µl de chaque solution d'extrait ont été ajoutés dans la première ligne de microplaques. Ensuite, une série de dilution à raison ½ a été établie afin d’obtenir des concentrations allant de 50 mg/ml jusqu’à 0,09 mg/ml. Enfin, chaque puits est ensemencé par 10 µl de suspension microbienne. Trois contrôles ont été effectués, le contrôle stérile (Milieu Sabouraud), le contrôle négatif (Milieu Sabouraud et inoculum) et le contrôle positif (Milieu Sabouraud, inoculum et produits de synthèses). Nous avons également testé 3 produits synthétiques de références aux doses homologuées à savoir : un

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polyène (Nystatine) : 1µg/ml, un allylamine (Terbinafine) : 1µg/ml et un dérivé d'azoles (Fluconazole) :0.5µg/ml.

Les microplaques sont scellées au parafilm dans des conditions aseptiques, puis incubées à 37°C, pendant 48h. La croissance des levures a été révélée par l'ajout de 10 µl dans chaque puits du tétrazolium, un indicateur de viabilité [MTT : 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltétrazolium bromide)]. Les microplaques sont ré-incubées à 37 °C pendant 24h. L’absence de la coloration bleu-violette dans les puits indique un effet inhibiteur de la croissance de la levure.

 Profil fongicide ou fongistatique :

La détermination du profil fongicide ou fongistatique nécessite l’ensemencement en stries de 100 µl des contenus des puits ayant une concentration supérieure ou égale à la CMI transférés sur un milieu de culture Sabouraud. L’incubation a eu lieu à 37°C pendant 24 heures. L’effet fongistatique se traduit par une reprise de croissance tandis que l’effet fongicide indique une absence totale de croissance.

VIII-2/ Lecture des résultats obtenus :

Les quatre extraits de produits lourds aux concentrations décroissantes d’Artemisia mésatlantica M. ont été évalués pour leur activité antifongique vis-à- vis des cinq souches de Candida albicans. Les résultats des tests antifongiques et ceux de l’efficacité des produits de synthèses sont illustrés dans les figures (7

164 DCM : Dichlorométhane H : Hexane Met : Méthanol E : Aqueux Nys : Nystatin Flu : Fluconazole Ter : Terbinafine

Figure 7 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits

organiques et aqueux d’Artemisia mesatlantica sur la croissance de

165 DCM : Dichlorométhane H : Hexane Met : Méthanol E : Aqueux Nys : Nystatin Flu : Fluconazole Ter : Terbinafine

Figure 8 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits

organiques et aqueux d’Artemisia mesatlantica sur la croissance de la

166 DCM : Dichlorométhane H : Hexane Met : Méthanol E : Aqueux Nys : Nystatin Flu : Fluconazole Ter : Terbinafine

Figure 9 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits

organiques et aqueux d’Artemisia mesatlantica sur la croissance de la

167 DCM : Dichlorométhane H : Hexane Met : Méthanol E : Aqueux Nys : Nystatin Flu : Fluconazole Ter : Terbinafine

Figure 10 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits

organiques et aqueux d’Artemisia mesatlantica sur la croissance de la

168 DCM : Dichlorométhane H : Hexane Met : Méthanol E : Aqueux Nys : Nystatin Flu : Fluconazole Ter : Terbinafine

Figure 11: Concentration minimale inhibitrice (CMI) des

extraits organiques et aqueux d’Artemisia mesatlantica sur

169

Les résultats obtenus de l’activité antifongique des extraits organiques et aqueux d’Artemisia mesatlantica montrent que les cinq souches de Candida albicans étudiées sont toutes sensibles mais à des différents degrés. En effet, toutes les souches présentent une sensibilité variable selon la nature de l’extrait et la concentration utilisée.

De ce fait, les valeurs des CMI varient suivant les extraits et la souche fongique. Elles sont comprises entre 3,12 mg/ml et 0,19 mg/ml (Tableau 4).

Tableau 4: Concentrations minimales inhibitrices (CMI) des extraits sur les cinq

souches de Candida testées

Extraits CMI (mg/ml) L14 L2 L12 L5 L13 Dichlorométhane 1,56 3,12 1,56 3,12 1,56 Hexane 1,56 3,12 0,39 1,56 0,78 Méthanol 1,56 0,39 0,39 0,78 0,19 Aqueux 1,56 1,56 0,39 1,56 0,19

De façon générale, tous les extraits d’Artemisia mesatlantica ont été actifs, sur les cinq souches de Candida albicans.

L’analyse des résultats indiquent que les deux extraits méthanolique et aqueux d’Artemisia mesatlantica ont un pouvoir puissant vis-à-vis de Candida albicans. Ces deux extraits ont un même effet à des CMI identiques pour les trois souches L14, L12 et L13. En effet, ils ont totalement inhibé la croissance de la souche L13 à une CMI de 0,19 mg/ml, de la souche L12 à 0,39 mg/ml et de la souche L14 à 1,56 mg/ml. Pour les souches L2 et L5, l’extrait méthanolique a donné un meilleur potentiel avec des CMI de l’ordre de 0,39 mg/ml et 0,78 mg/ml respectivement. Ces deux souches ont montré pour l’extrait aqueux une même CMI et qui est de l’ordre de 1,56 mg/ml.

L’extrait hexanique a entrainé une forte inhibition des deux souches L12, L13 à une CMI de 0,39 mg/ml et 0,78 mg/ml respectivement, des souches L14 et L5 à 1,56 mg/ml et de la souche L2 à 3,12 mg/ml.

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L’extrait de dichlorométhane a eu un effet inhibiteur sur les deux souches L5 et L2 à une CMI de 3,12 mg/ml et sur les trois souches L14, L12 et L13 à 1,56 mg/ml.

De la synthèse des résultats des quatre extraits testés, il ressort que les souches L13, L12 de Candida albicans, isolées respectivement de prélèvement buccal et au niveau du cathéter ombilical, sont les plus sensibles aux extraits d’Artemisia

mesatlantica, surtout à celui issu de la décoction et de la macération au méthanol.

Concernant, les produits de synthèse de référence, le Terbinafine et le Fluconazole, n’ont montré aucun effet inhibiteur sur la croissance de toutes les souches de Candida albicans, seul le Nystatin a été actif mais uniquement sur les souches L14, L12 et L5.

Notant que le DMSO utilisé comme solvant pour solubiliser l’extrait hexanique et celui issu du dichlorométhane a été préalablement testé et il n’a montré aucun effet inhibiteur sur la croissance des cinq souches de Candida albicans.