Méthodes

2.3.1 Tests de Diagnostics Rapides du paludisme (TDR) [20]

➢ Principe

De nombreux tests sont disponibles sur le marché et les comparer les uns aux autres est délicat. Le principe des TDR est basé sur la reconnaissance des antigènes (Histidine-Riche Protéine II (HRP2)) par un anticorps monoclonal spécifique contenu dans la cassette ou la bandelette du TDR ; cette reconnaissance se fait par immuno- chromatographie, la réaction antigène-anticorps se révélant par l'apparition d'une bande de couleur mauve. Paracheck test : c'est un test manuel sur bandelettes. La sensibilité est estimée entre 77 et 98 %, soit plus de 100 parasites par microlitre de sang, avec une spécificité au Pf de 83 à 98 % [21]. Un résultat positif se traduit par l'apparition des bandes tests et contrôle. Un résultat négatif se traduit par l'apparition de la bande contrôle seul. Un résultat est invalide en l'absence de bande contrôle ; dans ce cas, il faut rependre l'examen avec un nouveau test. L'apparition des bandes est rapide 15 mn en moyenne (en fonction du type de TDR).

➢ Technique

Vérifier la date de péremption de la cassette de TDR, utiliser une surface propre et plane, porter des gants, mettre le test à la température ambiante, ouvrir le test juste au moment de l'emploi, mentionner le code ou le nom de la poche, le numéro et la date.

Piquer d'un coup sec et rapide avec une lancette/vaccinostyle stérile sur le bord du saucisson de la poche de sang et prélever 5 microlitres de sang à l'aide de l'anse de prélèvement.

NB : Pour le TDR, il n'est pas nécessaire d'essuyer la première goutte de sang.

Déposer les 5 microlitres de sang dans la fenêtre carrée puis déposer quatre gouttes (selon type de TDR disponible) de la solution tampon dans la fenêtre ronde verticalement.

Laisser reposer le test sur la surface plane, attendre au plus 15 minutes pour la lecture des résultats.

NB : Il est nécessaire d'attendre 15 minutes pour déclarer que le test est négatif.

Mettre la lancette dans le conteneur de sécurité après usage.

2.3.2 Confection de la Goutte Epaisse (GE) et du Frottis Sanguin (FS) [20]

Le diagnostic de certitude du paludisme repose sur deux techniques : la goutte épaisse et le frottis.

➢ Confection de la GE

La goutte épaisse permet une « concentration » Plasmodiums éventuellement présents dans l'échantillon examiné, si bien que la lecture en est normalement plus rapide et la sensibilité plus élevée. La goutte épaisse comme le frottis sanguin reste aussi une technique de référence pour l'OMS. Leur fiabilité est dépendante de la parasitémie du sujet infecté, de la qualité de la coloration de la lame, ainsi que de l'expérience et de l'attention du technicien qui les effectue [21]. Pour sa réalisation, il faut :

➢ Confection du frottis sanguin

Le frottis sanguin reste la technique de référence pour l'OMS. Il permet d'identifier l'espèce plasmodiale éventuellement présente dans l'échantillon examiné. Pour sa réalisation, il faut :

Disposer le poste de travail, rassembler le matériel à utiliser.

Tenir la lame à l'une des extrémités (par ses bords) entre le pouce et l'index de la main gauche (pour un droitier), à l'aide de la pipette pasteur, déposer une goutte de sang à environ 2 mm de l'autre extrémité de la lame.

Prendre la lamelle et la placer sur la lame à quelque cm au-dessus de la goutte, incliner la lamelle à 45⁰ puis glisser légèrement la lamelle vers la goutte de façon à amener son bord au contact de la goutte de sang, puis attendre l'étalement du sang par capillarité.

Tirer d'un geste uniforme et continu le frottis jusqu'à l'épuisement de la goutte de sang.

Le frottis a une langue de chat.

Déposer sur une lame, une goutte de sang de la grosseur d'un grain de blé, utiliser un coin de la lamelle qui a servir à confectionner le frottis sanguin ; Etaler en partant du milieu de la goutte de sang par au plus six (06) mouvements circulaires continus, en spirales pour obtenir une couche épaisse et uniforme ayant à peu près 1 cm de diamètre.

Prévention du paludisme transfusionnel par l'utilisation des Tests de

Diagnostics Rapides (TDR)

2020

Réalisé par Sènami F. Lionel B. AKOTAN 14

Identifier et sécher la lame.

Pour séchage laisser la lame confectionnée à plat horizontalement sur la paillasse ou sur un râtelier pour permettre un séchage uniforme puis Identifier la lame en inscrivant sur la base du frottis sanguin séché les initiales ou numéro d’ordre de notre échantillon d'étude.

Pour fixation les frottis plonger le dans un bain de méthanol, la lame en position inclinée pour préserver la goutte épaisse et déposer la lame sur un râtelier avec le frottis orienté vers le bas.

2.3.3 Coloration des lames

Déposer les lames confectionnées sur les supports. Prélever à l'aide d'une pissette la solution de Giemsa dilué à 10 %, puis faire couvrir toutes les lames avec la solution prélevée. Laisser agir pendant 10 à 15 minutes, rincer à l'eau de robinet.

Laisser sécher à l'air en position inclinée (la GE orientée vers le haut) sur le râtelier [22].

2.3.4 Lecture

L'examen se fait à l'objectif x100.

Faire la mise au point à l'objectif x10 puis rechercher toujours à l'objectif x10, une partie bien colorée de la lame de GE sans dépôt de colorant et riche en cellules séparées les unes à côté des autres. Mettre une goutte d'huile à immersion sur la goutte épaisse [14].

Faire la mise au point à l'objectif x100. Parcourir la lame suivant la méthode de Rampart et procéder à l'identification correcte de l'espèce plasmodiale sur FS si la GE est positive.

2.3.5 Détermination de la densité parasitaire sur la GE

Le calcul de la densité parasitaire sur goutte épaisse est établi par rapport aux leucocytes. Il faut compter le nombre de parasites que l'on voit et compter au moins 200 leucocytes en même temps. On estime que le nombre moyen de leucocytes est de 6000 par µL de sang. Si le nombre de parasites comptés est inférieur à 100 pour 200 leucocytes, la numération est effectuée par rapport à 500 leucocytes [1]. La Parasitémie est exprimée par microlitre de sang. Le calcul du nombre de parasites par µL est :

Le résultat tient compte des éléments ci-après :

✓ Genre : Plasmodium

✓ Espèces identifiées : P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. Knowles 2.3.6 Présentation du résultat

En cas de résultat négatif on parle d'absence de trophozoïtes de Plasmodium et en cas de résultat positif Présence de trophozoïtes de Plasmodium plus le nom de l'espèce.

2.3.7 Evaluation des performances du TDR utilisé [4]

Méthodes de calcul de la sensibilité (Se), la spécificité (Sp), la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN) du TDR utilisé.

• Sensibilité (Se) : est la capacité d'un test de TDR à identifier correctement les poches infectées par le plasmodium à la GE ;

• Spécificité (Sp) : est la capacité d'un test à identifier correctement les poches non infectées par le plasmodium à la GE ;

• Valeur Prédictive Positive (VPP) : c’est la probabilité qu'une poche ayant un résultat positif soit réellement infectée par le plasmodium à la GE ;

• Valeur Prédictive Négative (VPN) : c’est la probabilité qu'une poche ayant un résultat négatif ne soit pas infectée par le plasmodium à la GE.

Tableau 1 : Tableau de contingence 2×2 pour l’évaluation de la performance du TDR

GE TOTAL

Négatif Positif

TDR Négatif VN FN VN+FN

Positif FP VP FP+VP

TOTAL VN+FP FN+VP

• VP (Vrais Positifs) : ce sont les poches chez lesquels le TDR est positive et la GE est positive ;

• FP (Faux Positifs) : le TDR est positif et la GE est fausse ;

• FN (Faux Négatifs) : le TDR est négatif et la GE est positive

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• VN (Vrais Négatifs) : le TDR est négatif et la GE est négative.

Il s'agit donc de la probabilité conditionnelle qu'on peut noter : Sensibilité=VP ÷ (VP+FN)

De manière similaire, on a : Spécificité= VN ÷ (VN+FP) VPP= VN ÷ (VP+FP) VPN= VN ÷ (VN+FN)