Méthodes de biologie cellulaire

2-1/ Culture de cellules Ba/F3 :

Les cellules Ba/F3 sont issues d’une lignée murine de type lymphocytaire (DSM ATCC 300) dont la survie nécessite la présence d’interleukine 3 (IL-3). Elles sont cultivées à 37°C sous 5% de CO2, dans du RPMI 1640 supplémenté de 10% en sérum de veau fœtal (SVF) et de 5% d’un mélange d’antibiotiques streptomycine/pénicilline. Pour la lignée parentale, dite Ba/F3wt, le milieu est complété avec de l’IL-3 (1 à 5 U/ml).

Les cellules Ba/F3 exprimant de manière stable les protéines de fusion Bcr-Abl, nommées Ba/F3p190 et Ba/F3p210, ont acquéri une indépendance à l’IL-3. Ces cellules ont été obtenues par transfection stable avec les plasmides pGD-190 et pGD-210 (fournis par le Dr Daley, Whitehead Institute, Cambridge, MA). Un premier mutant a été réalisé à partir du plasmide pGD-210. Une mutagénèse dirigée a été réalisée dans le domaine DH pour induire une inactivation de ce domaine, comme pour Sos et Dbl (Zheng et al., 1997). Ce mutant appelé p210S509A a été cloné dans les cellules Ba/F3wt et les clones sont sélectionnés par leur indépendance à l’IL3 (Daley et al., 1988).

Ensuite, les Ba/F3p190 ou Ba/F3p210 clonées ont été transfectées de manière stable avec Vav (wt) ou un mutant dominant positif de l’activité GEF de Vav, VavL, ou un mutant dominant négatif pour l’activité GEF, VavT205A (plasmide pEF4/HisA - Invitrogen). Ces cellules ont été nommées Ba/F3p190Vav, Ba/F3p190VavL, Ba/F3p190VavT205A, Ba/F3p210Vav, Ba/F3p210VavL et Ba/F3p210VavT205A.

Les cellules Ba/F3p190 et de Ba/F3p210 ont aussi été transfectées de manière stable avec deux vecteurs exprimant les protéines ADF/destrine ou cofiline1. Ces constructions ont été réalisées dans le plasmide pcDNA6 myc/His (Invitrogen) possédant un gène de résistance à la blasticidine (Invivogen). Les cellules ont été clonées classiquement comme décrit plus haut.

153 2-2/

Transfection des cellules Ba/F3 :

2-2-1/ Electroporation :

Les cellules sont lavées deux fois dans du PBS puis reprises dans 800 µl de PBS. On y ajoute 35 µg de plasmide puis le tout est mis à incuber 5 min à 4°C. On procède ensuite à l’électroporation dans une cuve d’électroporation sous 250 V et 1500 µF pendant 20 ms. Les cellules électroporées sont mises dans du milieu complet à 4°C pendant 10 min avant d’être mises en culture. L’antibiotique de sélection est ajouté 48 h plus tard.

2-2-2/ Transfection avec NucleoTransfector AMAXA :

Cette nouvelle technologie apparue durant ma thèse a permis de transfecter de manière beaucoup plus efficace les cellules Ba/F3. Pour exemple, les rendements de transfection sont passés de 1% à plus de 80%. Des transfections transitoires sont ainsi possibles, des déplétions par siRNA ont donc été réalisées sur des effecteurs de RhoA et Rac1 (Figure MM 2).

Les cellules à transfecter sont diluées quelques jours avant la transfection pour permettre une croissance optimale. 2.106 cellules sont collectées et centrifugées 10 min à 90xg. Le surnageant est aspiré et le culot repris dans 100 µl de Nucleofector solution V préalablement réchauffée à température ambiante. On ajoute 2 µg de plasmide ou 3 µg de siRNA à ces 100 µl de solution V. Ce mélange est transféré dans une cuvette AMAXA® qui est ensuite insérée dans le Nucleofector sous le programme T27. Une fois la transfection terminée, le mélange est repris doucement avec 500 µl de milieu RMPI complet chaud et transféré dans un puits d’une boite 6 puits contenant déjà 2 ml de RPMI complet chaud. Les cellules sont laissées dans l’incubateur pendant 24h mais les premiers résultats sont

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amorces orientation Séquence

LIMK1 sens 5'ACAGAGTACATCAAGGGCG

antisens 5'GTGGGAGTTGAGGTCTCG

LIMK2 sens 5'TCGGGACTACTTGGGACC

antisens 5'GTTTCTGTAACTCATACTACCGCT

ADF/destrine sens 5'TTTGTATGACGCCAGCTTTGAGA

antisens 5'TTTCAGCAATACAGGTCCGA

Cofiline1 sens 5'ATGGAAGCAGGACCAGTAAG

antisens 5'AGAGGTGAAGCACAGGGAAA

Tableau MM 2 : Séquences des sondes pour les RT-PCR quantitatives

2-3/ Mesure de la croissance cellulaire :

5.105 cellules sont mises en culture en présence de sérum. Les premiers comptages sont faits toutes les 12h et sont réalisés grâce à la méthode classique avec une cellule de Malassez. Pour réduire les erreurs de comptage, plusieurs comptages sont faits pour un même point.

2-3-2/ Incorporation de thymidine [3H] :

Les différentes lignées cellulaires sont mises en culture en absence de sérum pendant 48h afin de bloquer leur croissance. Elles sont ensuite diluées à 2.105 cellules pour 200 µl par puit dans une boîte 96 puits et cultivées en présence de sérum et de 1 mCi de thymidine [3H] à différents temps. La croissance cellulaire est alors arrêtée à -20°C. Après décongélation, les cellules sont aspirées et lavées avec un Semiautomatic Cell Harvester (Skatron) puis déposées sur un papier filtre FilterMAT (Skatron). Le papier est ensuite mis dans une fiole de comptage avec 1 ml de liquide à scintillation puis le tout est placé dans le compteur à scintillation Kontron βmatic.

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2-4/ Enregistrement en microscopie time-lapse des mouvements cellulaires

Un total de 105 cellules, traitées par différents agents ou non, sont incorporées dans 2mg/ml de Growth Factor Reduced MatrigelTM (Becton-Dickinson) préalablement dilué avec du RPMI à volume équivalent. Le mélange est déposé au centre d’un anneau reposant sur une boite de Pétri à fond de verre. Les boites sont ensuite laissées pendant 1 h à 37°C pour permettre la polymérisation du Matrigel.

Les comportements cellulaires sont ensuite analysés en contraste différentiel d’interférence sur une station confocale Olympus FV1000, à l’objectif 60. Les boîtes sont maintenues à 37°C sur une petite plaque chauffante. Une image est prise toutes les 2 secondes pendant 5 à 10 minutes et les enregistrements sont accélérés 12 fois pour être présentés sur un film.

2-5/ Tests d’invasion cellulaire en chambre de Boyden :

Ces tests sont réalisés avec des inserts BD Biocoat™ Growth Factor Reduced

MATRIGEL™ Invasion Chamber de BD Biosciences. La Matrigel contenu dans les inserts

est d’abord réhydraté avec 500 µl de milieu de culture pendant deux heures à 37°C. Une fois le Matrigel polymérisé, le milieu est aspiré doucement et remplacé par 500 µl de milieu complet avec 5.104 cellules. 750 µl de milieu complet sont rajoutés dans les puits correspondant aux inserts pour éviter un effet de siphon sur les cellules. Le comptage des cellules ayant traversé le Matrigel de l’insert est effectué à intervalles réguliers dans les puits grâce à une cellule de Malassez.

Une mesure de la prolifération cellulaire est effectuée en parallèle et dans les mêmes conditions sur 5.104 cellules dans 500 µl de manière à évaluer la part de la prolifération cellulaire parmi le comptage des cellules ayant traversé. Une pondération du comptage est effectuée au prorata de la mesure de prolifération de chaque type cellulaire.

2-6/ Test d’invasion cellulaire en collagène :

Cette technique permet d’évaluer la capacité de cellules à envahir une matrice de collagène. Des gels de collagène sont coulés dans des puits de boite 96 puits et laissés 45 min à 37°C, 5% CO2. On ajoute ensuite 5.104 cellules dans 100 µl de milieu sur le collagène. Les cellules sont laissées 24 h et 48 h pour leur permettre d’envahir le collagène. A l’issue de ces temps d’invasion, le milieu est enlevé, les cellules sont fixées par du

156 glutaraldéhyde 3% dans du PBS pendant 45 min à 37°C. Une seconde étape de fixation par une solution de 30% de méthanol avec 0.1% de Bleu de toluidine pendant 45 min à température ambiante est effectuée. Trois rinçages successifs à l’eau sont ensuite réalisés pour ôter le surplus de bleu de toluidine. Les gels sont ensuite extraits des puits à l’aide d’un scalpel, coupés en deux et déposés sur une lame, puis observés au microscope à contraste de phase. Un comptage des cellules est réalisé, ainsi qu’une mesure de la profondeur d’invasion. D’autre part, la morphologie des cellules invasives peut être évaluée.

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