Méthodes biochimiques

3-1 / Préparation de lysat cellulaire :

Les cellules Ba/F3, cultivées en suspension sont centrifugées à 1500xg pendant 5 minutes, pour récupérer les cellules sous forme d’un culot. Deux lavages par du PBS froid sont effectués pour éliminer les débris cellulaires. Après la dernière centrifugation, le culot est repris dans le tampon de lyse cellulaire (100 µ l pour 1.106 cellules). Le lysat est ensuite sonifié grâce à un sonificateur Branson (puissance 70 W) pendant 2 fois 30 secondes à 90%. Ce lysat cellulaire peut être congelé à –20°C, ou utilisé directement.

Tampon de lyse cellulaire Tampon « Urée »

Tris HCl (pH 7,4) 50 mM Urée 7 M NaCl 100 mM Thiourée 2 M MgCl2 5 mM Triton X100 0.5 % NP-40 1% DTT 1/500ème glycerol 10% AEBSF 1/200ème

“cocktail ” anti-protéases (Roche) 1/50ème

3-2 Dosages protéiques :

Cette méthode permet de déterminer des quantités de protéines de l’ordre du microgramme (Bradford, 1976). L’échantillon protéique contient 0 à 100 µg de protéines dans un volume de 20 µl. On ajoute 2 ml du réactif de Bradford. Après agitation et incubation pendant 5 minutes, l’absorbance est mesurée à 595 nm. Une gamme protéique de sérum albumine bovine (BSA) est mesurée en parallèle, permettant ainsi de déduire les concentrations protéiques des échantillons.

3-2-2 / Méthode utilisant l’acide bicinchoninique (BCA) :

Cette méthode permet la détermination de quantités de protéines dans une gamme de 10 à 50 µ g. Dans ce dosage, l’acide bicinchoninique forme un complexe stable avec les ions Cu2+, eux-mêmes réagissant avec la liaison peptidique comme dans la réaction du biuret.

158 Un volume de réactif B (CuSO4, 5H2O 4%) est mélangé à 50 volumes de réactif A (sel dissodique d’acide bicinchonidique 1%, Na2CO3, (1H2O) 2%, tartrate dissodique 0,16%, NaOH 0,4%, NaHCO3 0,95% pH=11,25).

Chaque échantillon est dosé en double. Pour chaque échantillon, à 100 µl de solution protéique, sont ajoutés 2 ml de réactif. Chaque tube est mélangé puis incubé 30 minutes à 37°C. Les absorbances sont ensuite déterminées au spectrophotomètre à 562 nm et comparées à celles de la gamme étalon de BSA, permettant ainsi de déduire les concentrations protéiques.

3-3 / SDS PAGE et Western-Blot :

3-3-1/ Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) :

Cette technique permet la séparation de protéines en fonction de leur masse relative (Mr). Les gels de concentration et de séparation sont coulés successivement entre une plaque d’alumine et une plaque de verre, espacées de 0,75 mm. Le gel de concentration contient 4% de polyacrylamide et le gel de séparation 6 à 15% de polyacrylamide, suivant la Mr des protéines à séparer. Les échantillons contiennent 30 µg de protéines et sont complétées avec du tampon de dissociation Laëmmli 2X (62.5 mM Tris pH=6.8, 15% glycérol (v/v), 2.3% SDS (p/v), 0.001% bleu de bromophénol (p/v) et 5% α-monothiogléycérol (v/v)). Les protéines sont dénaturées 5 minutes à 95°C. Le contenu de chaque tube est déposé dans les puits du gel de concentration ainsi que 5 µl de marqueurs colorés de poids moléculaire (Mr de 14 à 220 kD) (RainbowTM protein molecular weight marker, Amersham). La migration

s’effectue à 28 mA dans du tampon d’électrophorèse de Laëmmli (62.5 mM Tris pH=8.3, 380 mM glycine et 0.1% SDS (p/v)).

3-3-2/ Electrotransfert sur membrane de nitrocellulose :

Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose 0,45 µm (Protran BA85, GE Healthcare). Dans la cuve à électrotransfert, le sandwich est placé de telle sorte que le gel est du côté de la borne négative et la membrane de nitrocellulose du côté de la borne positive de la cuve. Le transfert est effectué à 4°C, à 200 mA, sous agitation, pendant une à deux heures, suivant la taille des protéines à transférer, dans un tampon de transfert Tris-Glycine (24.8 mM Tris pH8.3, 150 mM glycine). Après transfert, la membrane est lavée trois fois 5 minutes dans du PBS-Tween 0,1%.

159 3-3-3/ Détection immunologique des protéines :

Toutes les opérations sont conduites à 4°C sous agitation. La membrane est d’abord saturée dans une solution de TBS-Tween 0,1% (25 Mm Tris pH8.6 , 137 mM NaCl et 0.1% Tween 20) contenant 5% de lait écrémé pendant 1h. Elle est ensuite lavée 3 fois dans du TBS-Tween 0,1% puis placée soit 1 heure soit toute la nuit dans un volume minimal de TBS-Tween 0,1%, de façon à la recouvrir, en présence d’un anticorps primaire dirigé contre la protéine d’intérêt (Tableau MM 3). Elle est ensuite lavée 3 fois dans du TBS-Tween 0,1% puis mise en présence de l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase et dirigé contre l’immunoglobuline de l’anticorps primaire (Tableau MM 4). La réaction est conduite pendant une heure. La membrane est de nouveau lavée 3 fois avec du TBS-Tween 0,1%. La révélation enzymatique par chémiluminescence, effectuée grâce au kit ECL (Amersham) permet de détecter les protéines d’intérêt de manière très sensible. La révélation se fait par autoradiographie en quelques secondes. Afin de quantifier les résultats de Western-Blot, les mesures de densitométrie sont réalisées avec le logiciel Prism 3.0.

160

Anticorps Type Western-blot Immunoprécipitation Fournisseur

Abl (8E9) Monoclonal 2 µg/ml 1,6 µg/ml BC Biosciences RhoA (26C4) Monoclonal 0,25 µg/ml 4 µg/ml Santa-Cruz

Rac1 (23A8) Monoclonal 2 µg/ml 4 µg/ml BD Biosciences

poly-histidine Monoclonal 2 µg/ml 6 µg/ml Sigma

Vav1 Polyclonal 2 µg/ml 4 µg/ml Cell Signaling

ROCK1 Polyclonal 2 µg/ml / Santa-Cruz

ROCK2 Polyclonal 2 µg/ml / Santa-Cruz

PAK1 ( αPAK) Polyclonal 4 µg/ml / Santa-Cruz

PAK4 (γPAK) Polyclonal 4 µg/ml / Santa-Cruz

LIMK1 Polyclonal 4 µg/ml / ABCAM

LIMK1-P Polyclonal 1 µg/ml / ABCAM

LIMK2 Polyclonal 0,5 µg/ml / ABCAM

LIMK2-P Polyclonal 1 µg/ml / ABCAM

CLM Polyclonal 2 µg/ml / Cell Signaling

CLM-P Monoclonal 1 µg/ml / Cell Signaling

cofiline1 Polyclonal 2,5 µg/ml / Cytoskeleton

cofiline1-P (Ser3) Polyclonal 1/1000 / ECM Biosciences

ADF/Destrine Polyclonal 2 µg/ml 2 µg/ml Sigma

SSH1L Polyclonal 1/1000 / Abnova

SSH2 Polyclonal 1/1000 / Abnova

SSH3 Polyclonal 1/1000 / Abnova

Actine Polyclonal 0,1 µg/ml / Sigma

161

Anticorps Origine Western-blot Fournisseur

Anti-IgG de lapin Singe 1/5000ème GE Healthcare Anti-IgG de souris Mouton 1/5000ème GE Healthcare Anti-IgG de chèvre Lapin 0,4 µg/ml Santa-cruz

162

3-4/ Electrophorèse bidimensionnelle :

Les cellules sont culottées directement sans subir de lavage au PBS, un seul lavage avec du milieu de culture est suffisant. Après une lyse par le tampon « Urée » (cf plus haut), 400 µg de protéines sont mélangés à 3,5 µ L de tampon IPG, pour un volume final de 350 µ L. Une bandelette de double dimension de 18 cm est utilisée, le pH allant de 6 à 11. La bandelette est placée dans le sarcophage, le lysat protéique est placé uniformément sur la bandelette et le tout est recouvert d’huile à double dimension. Le programme utilisé pour la séparation des protéines est de 10 h à 50 µA/bandelette, 1 h à 10 V, 3 h à 300 V, un gradient de 300 V à 5000 V en 6 h , 11 h à 5000 V et enfin 1 h à 8000 V.

Pour effectuer la seconde dimension, une solution d’équilibration est utilisée (50 mM Tris/Hcl pH6.8, 6 M Urée, 30% glycérol, 1% SDS), à laquelle est ajoutée 100 mg de DTT (pour 10 ml de solution) pendant 15 min. Les bandelettes sont ensuite mises dans la même solution d’équilibration à laquelle est rajoutée 0.45 g d’iodoacétamide (pour 10 ml).

Les bandelettes sont ensuite déposées au-dessus d’un gel d’acrylamide pour effectuer la deuxième dimension. La migration s’effectue 30 min à 50 V, 30 min à 100 V et en continu à 150 V. Un transfert est alors effectué comme décrit plus haut. Les membranes sont ensuite mises à incuber avec les anticorps anti-cofiline1 ou anti-ADF/destrine pour révéler les isoformes phosphorylés de ces protéines.

3-5/ Immunoprécipitations et co-immunoprécipitations :

400 µg de protéines sont repris dans trois volumes équivalents de tampon NET/MgCl2 (50 mM Tris pH=7.4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.05% NP-40 (v/v) et 5 mM MgCl2). Les échantillons sont mis à incuber en présence d’anticorps polyclonal ou monoclonal spécifique de la protéine à immunoprécipiter (Tableau MM 3) toute la nuit sous agitation à 4°C. Le lendemain, la précipitation est réalisée par ajout de protéine-G couplée à des billes de sépharose (pour les anticorps monoclonaux) ou par ajout de protéine- A couplée à des billes de sépharose (pour les anticorps polyclonaux) (Amersham). La réaction est réalisée pendant 1 heure sous agitation à 4°C. A la fin de la réaction, une courte centrifugation d’environ 15 secondes à 15000xg est effectuée pour sédimenter les billes. Trois lavages successifs avec du tampon NET/MgCl2 sont ensuite effectués.

163 L’immunoprécipitation peut être soit utilisée dans des réactions d’échange (après lavage avec du tampon NET/MgCl2), soit les protéines immunoprécipitées ou co- immunoprécipitées sont séparées en gel SDS-PAGE, suivi d’un Western Blot et d’une immunodétection par un anticorps approprié.

3-6/ Marquage intracytoplasmique pour cytométrie en flux :

Les cellules sont comptées et récoltées pour subir un lavage au PBS, suivi d’une centrifugation de 2 min à 500xg. 2.105 cellules sont réparties dans chaque puits d’une plaque 96 puits à fond rond. 50 µl de solution de fixation et de perméabilisation « Cytofi/Cytoperm » (kit BD Pharmingen) sont rajoutés sur les cellules pendant 25 min à température ambiante. Les cellules sont centrifugées 2 min à 500xg, le surnageant est éliminé et les cellules sont resuspendues en retournant la plaque. Deux lavages sont réalisés avec 100 µ L de Perm Wash (kit BD, à diluer 10 fois dans H2O distillée avant utilisation).

Les anticorps dilués dans le Perm Wash sont déposés dans les puits (40 µL/puits) et laissés 20min à 4°C dans l'obscurité. Deux lavages sont faits avec 100 µ L de Perm Wash et 100 µl de solution de fixation sont rajoutés dans chaque puits (PBS, Formaldéhyde 2,5%). Les cellules marquées sont transférées dans des tubes à cytomètre. Les analyses sont réalisées au cytomètre en flux (FACscanto II, BD).

3-7 /Le marquage immunologique :

Les cellules Ba/F3 sont des cellules en suspension, nous devons donc utiliser une matrice pour permettre aux cellules d’adhérer sur un support. Les lamelles de verre sont recouvertes de Matrigel pur (Sigma Aldrich) et laissées à sécher 30 min à température ambiante. 106 cellules sont lavées deux fois au PBS et rajoutées sur le Matrigel. Le tout est placé à l’incubateur pendant une nuit (37°C, 5% CO2).

Les cellules sont lavées deux fois au TBS et fixées par une solution de paraformaldéhyde 3% pendant 10 min à température ambiante. Les cellules sont ensuite lavées une fois au TBS puis perméabilisées avec une solution de 0.1% de Triton X100 pendant 2 min à température ambiante. Après un lavage au TBS, BSA 2%, les cellules sont mises en présence de tampon de saturation (10 % sérum de chèvre dans TBS) pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, les lamelles sont incubées avec 20 µl d’anticorps primaires pendant 1 h à température ambiante et lavées deux fois par une solution de 2%

164 BSA dans du TBS (Tableau MM 3). Les anticorps secondaires sont alors rajoutés sur les lamelles pendant 1 h à l’abri de la lumière (Tableau MM 3). Deux derniers lavages sont réalisés avec la solution TBS-2% BSA et les lamelles sont montées sur des lames grâce au milieu de montage « Vectashield fluorescence medium H-1000 » (Vector Lab. Inc.). Les lames sont analysées par microscopie confocale grâce à un microscope inversé (FV1000, Olympus IX81).

3-8 / Production et purification de protéines recombinantes :

Nous avons à notre disposition trois constructions en poly-histidine : Vav wt, Vav dominant négatif ou VavT205A, et Vav dominant positif ou VavL. Elles ont été clonées dans le vecteur pEF4/HisA (Invitrogen). Ce vecteur permet l’expression de nos protéines d’intérêt dans un système eucaryote comme notre modèle Ba/F3.

La purification des protéines Vav poly-histidine a été réalisée à l’aide du kit

MagneHis™ Protein Purification System de Promega. Ce kit est basé sur l’affinité de la

séquence poly-histidine pour le Nickel. Le lysat cellulaire est incubé avec des billes magnétiques chargées en Nickel sur lesquelles se fixent alors les protéines. Les billes sont ensuite retenues par un aimant puis lavées. Les protéines sont ensuite éluées par lavage à l’aide d’une solution d’imidazole à 500 mM.

3-8-2/ Production et purification de protéines recombinantes en fusion GST :

Afin d’étudier l’état d’activation des petites protéines G de la famille Rho, nous disposons du domaine CRIB de PAK (PAK-CD-GST) qui permet la fixation des formes actives des petites protéines G Rac1 et Cdc42, ainsi que le domaine RBD de la Rhotekine (RTK-C21-GST) qui fixe la forme active de la GTPase RhoA (données par JG Collard, Netherlands Cancer Institute, Amsterdam).

Des bactéries BL21, une souche d’E. Coli, sont transformées par les plasmides d’expression pGEX contenant les séquences nucléotidiques qui correspondent aux différentes protéines d’intérêt. Les colonies sont mises en pré-culture dans 10 ml de LBA à 37°C toute la nuit sous agitation. Le lendemain matin, la pré-culture est diluée dans 500 ml de LBA à 37°C sous agitation. La croissance cellulaire est suivie en mesurant l’absorbance à 600 nm jusqu’à atteindre 0,8. L’expression de la protéine de fusion est alors induite par de

165 l’IPTG à la concentration finale de 1 mM. La culture est poursuivie pendant 3 heures sous agitation à 20°C pour éviter la formation de corps d’inclusion. La culture est centrifugée à 3000xg pendant 15 minutes à 4°C. Le culot bactérien est repris et lavé avec du PBS. A ce stade, les bactéries peuvent être congelées à –80°C dans 1/20e de volume de LB/glycérol v/v ou utilisées immédiatement.

Les étapes suivantes se déroulent à 4°C. Les bactéries sont reprises dans 10 ml de PBS additionné d’antiprotéases et d’AEBSF ainsi que de DTT à la concentration finale de 5 mM. La suspension bactérienne subit deux ultrasonifications successives par un sonificateur Branson (puissance 70 W) pendant 30 secondes à 90%. On ajoute alors 1% de Triton X-100 et le tout est mis à agiter 1h à 4°C. Cette étape permet d’éliminer les possibles corps d’inclusion. Les débris cellulaires sont alors éliminés par centrifugation à 4500xg pendant 9 minutes. Le surnageant est récupéré et mis à incuber dans un tube Falcon (15 ml) avec 500 µl de billes de GSH-Sepharose (Pharmacia) et agité pendant une heure minimum à 4°C. Les billes sont récupérées par centrifugation 5 minutes à 2500xg, puis 3 lavages au PBS ou tampon de lyse sont effectués.

Les protéines peuvent être soit conservées liées aux billes de sépharose afin d’effectuer des précipitations par affinité, soit être éluées des billes.

Dans ce cas, après le dernier lavage, on ajoute aux billes 500 µl d’une solution de Tris-HCl pH 8 50 mM, contenant 10 mM de glutathion réduit permettant l’élution des protéines en fusion GST. Après une agitation de 5 minutes à 4°C, une centrifugation rapide (15 secondes) à 15000xg est effectuée et le surnageant est récupéré. Cette opération est renouvelée deux fois pour obtenir trois élutions successives des protéines en fusion GST. La quantité de protéines en fusion GST est appréciée sur gel de polyacrylamide coloré au bleu de Coomassie par rapport à une gamme de BSA.

3-9/ Précipitation par affinité de partenaires moléculaires (Pull Down) :

Après décongélation, un volume de lysat cellulaire correspondant à un total de 300 à 400 µg de protéines totales est repris dans trois volumes de tampon NET/MgCl2. Les lysats ainsi dilués sont incubés en présence de 2 à 5 µ g de protéines en fusion GST préalablement purifiées. Ces protéines en fusion GST sont fixées à des billes de glutathion sépharose. Le mélange est laissé sous agitation toute la nuit à 4°C.

166 A la fin de la réaction, une courte centrifugation d’environ 15 secondes à 15000xg est effectuée, qui permet de récupérer les billes de glutathion sépharose liées aux protéines en fusion GST avec leurs partenaires.

Trois lavages successifs avec du tampon NET/MgCl2 sont ensuite effectués.

Le produit de cette extraction par affinité est ensuite étudié par séparation en SDS-PAGE suivie d’un Western Blot.

3-9-2 / Extraction par affinité des formes actives des GTPases de la famille Rho :

Les cellules sont lavées dans du PBS puis lysées dans du tampon de lyse à hauteur de 5.105 cellules pour 100 µl de tampon. Chaque lysat, correspondant à un total de 300 à 400 µg de protéines totales, est dilué dans 3 volumes de tampon NET/MgCl2 et incubé en présence de 5 µg de protéines Elmo, RTK-C21 ou PAK-CD en fusion GST liées aux billes de glutathion sépharose. Ce mélange est laissé sous agitation pendant une nuit à 4°C.

Les billes et le complexe protéique sont récupérés par une courte centrifugation de 15000xg pendant 15 secondes et lavés 3 fois par du tampon NET/MgCl2.

L’analyse de cette extraction se fait par Western Blot en utilisant des anticorps dirigés contre RhoA, Rac1 et Cdc42.

3-10 / Mesure de l’activité d’échange en mant-GDP :

Cette méthode fait intervenir un fluorochrome couplé au GDP, le 3’-(N- methylanthraniloyl)-2’-deoxy-GDP ou mant-GDP. Cette molécule fluorescente a une longueur d’onde d’excitation de 360 nm et une longueur d’onde d’émission de 460 nm. L’intensité de la fluorescence émise par le mant-GDP diffère selon sa position à l’intérieur ou à l’extérieur de la GTPase : un phénomène de résonance avec les résidus tryptophane de la GTPase entraîne l’augmentation de l’intensité de fluorescence lorsque le mant-GDP est inséré dans le site nucléotidique, par rapport à la forme libre.

Cette méthode permet donc d’analyser en temps réel, avec un lecteur de fluorescence, la réaction d’échange GDP/GTP des petites protéines G de la famille Rho. Cette technique nécessite comme précédemment une charge préalable des GTPases en fusion GST avec le mant-GDP. On charge donc 1,5 µmol de petites protéines G en fusion GST avec du mant-GDP par une incubation de 45 minutes à 37°C avec 2 ml de tampon de charge. La réaction de charge est stoppée dans la glace par l’ajout de 5 mM de MgCl2. Cette

167 solution de GTPases chargées en mant-GDP peut être utilisée toute la journée à condition d’être conservée dans la glace.

La réaction d’échange se fait par l’addition de 200 µl de solution de GTPases chargées en mant-GDP en présence d’un facteur d’échange ou d’EDTA (10 mM) et 100µM final de GTP. Ce mélange est réalisé sur une plaque 96 puits, permettant ainsi une lecture en temps réel de la fluorescence pendant 15 minutes grâce à un lecteur de fluorescence (FluoroCount PAKARD). tampon de charge Tris HCl (pH 7,5) 20 mM NaCl 100 mM DTT 1 mM BSA 50 µg/ml Solution mant-GDP (50µM) 16 µl qsp H2O 2 ml

168

169

A

Aghazadeh, B., Lowry, W. E., Huang, X. Y. and Rosen, M. K. (2000). Structural basis for relief of autoinhibition of the Dbl homology domain of proto-oncogene Vav by tyrosine phosphorylation. Cell 102, 625-33.

Aghazadeh, B., Zhu, K., Kubiseski, T. J., Liu, G. A., Pawson, T., Zheng, Y. and Rosen, M. K. (1998). Structure and mutagenesis of the Dbl homology domain. Nat Struct Biol 5, 1098-107.

Aloisi, A., Di Gregorio, S., Stagno, F., Guglielmo, P., Mannino, F., Sormani, M. P., Bruzzi, P., Gambacorti-Passerini, C., Saglio, G., Venuta, S. et al. (2006). BCR-ABL nuclear entrapment kills human CML cells: ex vivo study on 35 patients with the combination of imatinib mesylate and leptomycin B. Blood 107, 1591-8.

Amano, M., Ito, M., Kimura, K., Fukata, Y., Chihara, K., Nakano, T., Matsuura, Y. and Kaibuchi, K. (1996). Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase). J Biol Chem 271, 20246-9.

Arber, S., Barbayannis, F. A., Hanser, H., Schneider, C., Stanyon, C. A., Bernard, O. and Caroni, P. (1998). Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase. Nature 393, 805-9.

Arlinghaus, R. B. (2002). Bcr: a negative regulator of the Bcr-Abl oncoprotein in leukemia. Oncogene 21, 8560-7.

Aspenstrom, P., Fransson, A. and Saras, J. (2004). Rho GTPases have diverse effects on the organization of the actin filament system. Biochem J 377, 327-37.

Azam, M., Latek, R. R. and Daley, G. Q. (2003). Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell 112, 831- 43.

Bailly, M. and Condeelis, J. (2002). Cell motility: insights from the backstage. Nat Cell Biol 4, E292-4.

Bamburg, J. R. and Bernstein, B. W. (2008). ADF/cofilin. Curr Biol 18, R273-5. Baskaran, R., Chiang, G. G. and Wang, J. Y. (1996). Identification of a binding site in c-Ab1 tyrosine kinase for the C-terminal repeated domain of RNA polymerase II. Mol Cell Biol 16, 3361-9.

Bassermann, F., Jahn, T., Miething, C., Seipel, P., Bai, R. Y., Coutinho, S., Tybulewicz, V. L., Peschel, C. and Duyster, J. (2002). Association of Bcr-Abl with the proto-oncogene Vav is implicated in activation of the Rac-1 pathway. J Biol Chem 277, 12437-45.

Bellanger, J. M., Astier, C., Sardet, C., Ohta, Y., Stossel, T. P. and Debant, A. (2000). The Rac1- and RhoG-specific GEF domain of Trio targets filamin to remodel cytoskeletal actin. Nat Cell Biol 2, 888-92.

Ben-Neriah, Y. and Baltimore, D. (1986a). Structural modification of c-abl in lymphoma and leukemia. Curr Top Microbiol Immunol 132, 81-9.

Ben-Neriah, Y., Daley, G. Q., Mes-Masson, A. M., Witte, O. N. and Baltimore, D. (1986b). The chronic myelogenous leukemia-specific P210 protein is the product of the bcr/abl hybrid gene. Science 233, 212-4.

Bhatia, R. and McGlave, P. B. (1997). Autologous stem cell transplantation for the treatment of chronic myelogenous leukemia. Cancer Treat Res 77, 357-74.

Bhatia, R. and Verfaillie, C. M. (1998). The effect of interferon-alpha on beta-1 integrin mediated adhesion and growth regulation in chronic myelogenous leukemia. Leuk Lymphoma 28, 241-54.

Blanchoin, L. and Pollard, T. D. (2002). Hydrolysis of ATP by polymerized actin depends on the bound divalent cation but not profilin. Biochemistry 41, 597-602.

170 Blangy, A., Vignal, E., Schmidt, S., Debant, A., Gauthier-Rouviere, C. and Fort, P. (2000). TrioGEF1 controls Rac- and Cdc42-dependent cell structures through the direct activation of rhoG. J Cell Sci 113 ( Pt 4), 729-39.

Block, J., Stradal, T. E., Hanisch, J., Geffers, R., Kostler, S. A., Urban, E., Small, J. V., Rottner, K. and Faix, J. (2008). Filopodia formation induced by active mDia2/Drf3. J Microsc 231, 506-17.

Bourmeyster, N. and Vignais, P. V. (1996). Phosphorylation of Rho GDI stabilizes the Rho A-Rho GDI complex in neutrophil cytosol. Biochem Biophys Res Commun 218, 54-60.

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-54.

Brandt, D. T. and Grosse, R. (2007). Get to grips: steering local actin dynamics with IQGAPs. EMBO Rep 8, 1019-23.

Burbelo, P. D., Drechsel, D. and Hall, A. (1995). A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. J Biol Chem 270, 29071-4.

Bustelo, X. R. (2000). Regulatory and signaling properties of the Vav family.