Méthode d’estimation

Um dos papéis fundamentais desempenhados pelo BCR é a transmissão dos sinais de activação, provenientes do meio extracelular, para o interior da célula. A sinalização celular a partir do BCR inicia- se com a ligação de um antigénio ao seu local específico de ligação na molécula de mIg, o que gera um sinal que é transduzido intracelularmente pelas caudas citoplasmáticas do heterodímero Igα/Igβ (Monroe, 2006). Quando as células B estão em repouso, a maioria dos complexos do BCR, encontram- se distribuídos pela superfície celular sob a forma de monómeros (Pierce and Liu, 2010). No entanto, após a ligação de um antigénio multivalente solúvel, os vários complexos do BCR aglomeram-se numa determinada região membranar (raft lipídico) e ligam-se entre si, o que estimula o receptor. Os rafts lipídicos são microdomínios membranares especializados e dinâmicos, relativamente insolúveis e ricos em lípidos particulares, aos quais se associam preferencialmente proteínas importantes para a sinalização intracelular (Pierce, 2002). Para além dos complexos do BCR, também os complexos do co- receptor de células B, constituído por três moléculas (CD19, CD21 e CD81), se aglomeram nos rafts lipídicos.

Como resultado da estimulação do BCR, os resíduos de tirosinas dos ITAMs, localizados nas caudas citoplasmáticas do heterodímero Igα/Igβ, são fosforilados. Uma vez que o BCR não possui actividade cinásica, a fosforilação das tirosinas dos ITAMs é efectuada pelas cinases de tirosinas da família Src associadas ao BCR, tais como Lyn, Fyn e Blk. Este evento de fosforilação gera locais de ancoragem que permitem o recrutamento e a activação da cinase de tirosinas Syk, uma enzima determinante no

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processo de activação da célula B. A interacção entre Syk e os ITAMs é mediada pela presença na cinase de dois domínios SH2 (Src homology domain 2, domínio 2 de homologia com Src) de interacção com proteínas. Uma vez activada, Syk recruta outras moléculas, promovendo a sua fosforilação e activação. Desta forma, o recrutamento de Syk é essencial para a transmissão intracelular do estímulo pois possibilita a formação de um sinalossoma. Este constitui um complexo multiproteico funcional, constituído pela aglomeração de várias proteínas envolvidas em vias de sinalização celular, tais como Vav1, PLCγ2, PI3K, as proteínas adaptadoras (BLNK, NCK1, GRB2), entre outras. Todas as moléculas recrutadas para o BCR têm na sua sequência domínios de interacção com proteínas, tais como domínios SH2 e/ou SH3 (domínio 3 de homologia com Src), o que lhes permite interagir umas com as outras formando a “rede” de proteínas que define o sinalossoma. Na cauda citoplasmática de CD19 estão presentes 9 resíduos de tirosinas que são igualmente fosforilados por cinases da família Src, gerando locais de ancoragem adicionais para mais proteínas de sinalização, como Lyn, PI3K e Vav, amplificando desta forma o sinal de activação transmitido pelo BCR. A activação conjunta do co-receptor CD19 é imprescindível para a completa activação das células B maturas e para as seguintes etapas do seu desenvolvimento.

A formação do sinalossoma provoca a activação de diversas vias de sinalização celular, iniciando-se a transmissão de uma série de sinais intracelulares que culminam em respostas biológicas essenciais para diversos processos em células B (Kurosaki, 2002; Kurosaki and Hikida, 2009; Wang and Clark, 2003). As vias de sinalização activadas em resposta à ligação do BCR (revisto em Niiro and Clark, 2002) e que desempenham um papel importante na activação de células B maturas, isto é, as vias reguladas por PLCγ2, por PI3K, e pelas GTPases das famílias Rho/Rac e Ras, serão realçadas em seguida (Figura 1.3.).

A enzima PLCγ2 catalisa a hidrólise de PIP2 (fosfatidil inositol 4,5-bifosfato), um fosfolípido membranar, nos mensageiros secundários IP3 (inositol 1,4,5-trifosfato) e DAG (diacilglicerol), que promovem a abertura dos canais de cálcio e activam a cinase de serinas/treoninas PKC. O aumento dos níveis de cálcio intracelular e a activação de PKC promovem a activação dos factores de transcrição nuclear NF- AT (nuclear factor of activated T-cells) e NF-κB (nuclear factor kappa B), estimulando a transcrição de genes envolvidos na proliferação e diferenciação da célula B (Niiro and Clark, 2002).

11 A enzima PI3K é uma cinase de lípidos, que tem como função adicionar um grupo fosfato à posição 3 do anel de inositol dos derivados de fosfatidil-inositol (PI). A activação de PI3K catalisa assim a formação, no folheto interno da membrana plasmática, de fosfatidil inositol 3-fosfato (PIP), de PIP2 e preferencialmente fosfatidil inositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) gerando locais de ancoragem na membrana, responsáveis pelo recrutamento de enzimas que contêm domínios de homologia a pelestrina (PH, pleckstrin homology domains) com selectividade para estes lípidos. Uma das enzimas cuja activação depende de PI3K é a cinase de serinas/treoninas AKT. Após o recrutamento para a membrana e a sua activação, AKT fosforila uma série de moléculas, e activa o factor de transcrição nuclear NF-κB, promovendo a transcrição de determinados genes instrumentais para a proliferação, crescimento, sobrevivência e metabolismo celulares (Okkenhaug and Vanhaesebroeck, 2003).

As GTPases da família Rho/Rac e Ras constituem outro grupo de proteínas cuja função é propagar o sinal de activação do BCR. Estas proteínas existem nas células em duas formas diferentes: uma inactiva, ligada a GDP, e outra activa, ligada a GTP. A sua activação é dependente de outras proteínas que funcionam como factores de troca de nucleótidos de guanina (GEFs, guanine nucleotide exchange factors) e que, como tal, promovem a troca do GDP ligado às GTPases inactivas por GTP, o que as torna activas.

As proteínas da família Vav, activadas pela ligação do BCR, actuam como GEFs para as GTPases da família Rho/Rac. A activação destas GTPases promove a reorganização do citosqueleto de actina, crucial para a formação dos rafts lipídicos e a internalização do BCR. As proteínas Rho/Rac estão ainda envolvidas na activação das cinases PIP5-K (fosfatidil inositol 5-fosfato), p38 e JNK (c-Jun N-terminal kinase), o que resulta, respectivamente, na estimulação da produção de PIP2 e na activação de vários factores de transcrição nucleares essenciais para a transcrição de genes relacionados com a sobrevivência, proliferação e diferenciação (Bustelo, 2000; Tybulewicz and Henderson, 2009).

As GTPases da família Ras são activadas pelo seu factor de troca de nucleótidos específico, SOS, o que promove a activação da via das cinases de serina/treonina activadas por mitógeneo – via das MAPKs, e em especial, do subgrupo de proteínas ERK (extracellular signal-regulated kinases). Uma vez activadas, as proteínas ERK1/2 translocam-se para o núcleo onde promovem a alteração dos perfis de expressão génica e regulam o crescimento e diferenciação celular (Niiro and Clark, 2002).

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As várias vias de transdução de sinal não funcionam de forma isolada. Ao contrário, encontram-se interligadas, o que torna a sinalização celular um processo dinâmico e complexo. A activação de determinadas moléculas pertencentes a uma via específica pode influenciar, directa ou indirectamente, outra via adjacente. Algumas moléculas têm um efeito inibitório nas outras vias, enquanto outras podem ter um efeito estimulador, observando-se neste caso um sinergismo do sinal transmitido, contribuindo para a sua amplificação.

As respostas celulares à activação do BCR podem agrupar-se em dois grandes grupos: a estimulação de genes de sobrevivência e divisão celular, e a reorganização do citosqueleto de actina. São estas alterações ao nível molecular que estão na base dos processos de proliferação e diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento das células B. Interferências na transdução de sinal podem ter consequências graves para o sistema imunitário.

NCK1 PlCγ-2 PI3K PIP2 PIP3 mIg α/β α/β mIg Ag Syk Src Lyn/Fyn Vav PlCγ-2 AKT SOS CD19 CD19 Lyn Rafts lipídico Vav PKC NF-κB AKT PIP2 IP3 DAG Ca2+ NF-AT NF-κB Reorganização do citosqueleto de actina JNK Ras GDP Ras GTP ERK p38 Rho/ Rac GTP Rho/ Rac GDP Syk Núcleo Btk PI3K B L N K Btk Grb2 Legenda: Fosforilação Translocação para o núcleo

Figura 1.3. Transdução de sinal em células B activadas pela ligação do antigénio ao BCR. Ver legenda na

13 Figura 1.3. Transdução de sinal em células B activadas pela ligação do antigénio ao BCR. A ligação do

antigénio ao BCR promove a activação das cinases da família Src, nomeadamente Lyn, Fyn e Blk. Estas fosforilam os resíduos de tirosinas dos ITAMs, gerando locais de ligação para a cinase Syk. A ligação de Syk promove a sua activação, o que permite o recrutamento e a activação de várias proteínas envolvidas em sinalização celular, e a formação do sinalossoma. Como consequência da formação do sinalossoma, várias vias de transdução de sinal são activadas, como por exemplo a via da PLCγ2, da PI3K, e a das GTPases Rho/Rac e Ras (ver texto). Por fim, a activação destas vias de sinalização celular resulta na reorganização do citosqueleto de actina e na estimulação da expressão de genes promotores de sobrevivência e de proliferação celular. Figura adaptada de Niiro, 2002.