Mécanisme moléculaire de la macro-autophagie

La macro-autophagie, appelée autophagie dans la suite de ce manuscrit, peut être subdivisée en 3 étapes séquentielles : (i) l’initiation durant laquelle se forme la membrane d’isolation, (ii) l’élongation de la membrane et (iii) la maturation de l’autophagosome et la dégradation de son contenu par le lysosome (Yin et al., 2016) (Figure 22).

L’initiation

Recrutement des complexes ULK et Beclin 1 : L’initiation de l’autophagie nécessite l’activité du complexe ULK (UNC-51-like-kinase), composé des protéines ULK1, FIP200 (focal adhesion kinase [FAK] family kinase-interacting protein of 200 kDa) et ATG13 (Ganley et al., 2009). Les signaux activateurs de l’autophagie entraînent la déphosphorylation d’ULK1, qui peut alors phosphoryler ATG13 et FIP200. Ceci active le complexe ULK, qui rejoindrait alors la membrane du RE (Karanasios et al., 2013) en interagissant avec les protéines transmembranaires VMP1 (vacuole membrane protein 1) situées dans la membrane du RE. Cette interaction serait à l’origine de la formation du phagophore (Koyama-Honda et al., 2013) (Figure 23). La relocalisation de ULK1 à la membrane du RE permet le recrutement du complexe PI3K de classe III, plus communément appelé complexe Beclin 1 et composé des protéines Beclin 1 (BECN1), VPS34 (vacuolar protein sorting protein 34, aussi appelée PIK3C3 [phosphatidylinositol 3-kinase

catalytic subunit type 3] chez l’Homme) et ATG14. Le recrutement de ce complexe par ULK1 vers

le RE est dépendant de son interaction avec la protéine d’assemblage pro-autophagique AMBRA1 (autophagy and Beclin 1 regulator 1) phosphorylée par ULK1 (Di Bartolomeo et al., 2010). Au niveau de la membrane du RE, la protéine BECN1 interagit également avec VMP1 (Molejon et al., 2013) (Figure 23).

Formation de l’omégasome : La phosphorylation de BECN1 par ULK1 active la protéine VPS34 (Russell et al., 2013), permettant ainsi la production de PI(3)P (phosphatidylinositol-3- phosphate) essentiel à la formation des autophagosomes (Figure 23). Dans la membrane en

Figure 22 : Le processus macro-autophagique.

L’initiation de l’autophagie (1) requiert l’assemblage de diverses protéines en plusieurs complexes : le complexe ULK1, dont l’assemblage est régulé par mTOR (inhibiteur) et AMPK (activateur), le complexe Beclin 1 nécessitant la libération de la Beclin 1 suite à la phosphorylation de BCL2, et le complexe de liaison au PI3P, gouvernant la distribution de la machinerie permettant la formation de l’autophagosome. La formation et l’élongation du phagophore (2) requiert l’intervention des systèmes de conjugaison ATG12–ATG5–ATG16L1 et LC3. Dans le système de conjugaison ATG12–ATG5– ATG16L1, ATG12 se lie à ATG5 qui est alors attachée à ATG16L1. Ce complexe se dimérise puis interagit avec le complexe de liaison au PI(3)P formé par les protéines WIPI et DFCP1. Le complexe ATG12–ATG5–ATG16L1 favorise alors la conjugaison de LC3 après que LC3 ait été clivée en LC3-I et conjuguée avec une phosphatidylethanolamine pour former LC3-II. Ce conjugué est alors incorporé dans les membranes pré-autophagosomales et autophagosomales et peut alors interagir avec les récepteurs de l’autophagie. Le phagophore mature ensuite en autophagosome puis fusionne avec un lysosome (3) pour former l’autolysosome dans lequel le cargo séquestré sera dégradé (modifiée d’après Hansen et al., 2018).

Complexe Beclin 1

Initiation de

l’autophagie Formation et élongation du phagophore

Complexe d’initiation ULK1 Complexe de liaison au PI3P Système de conjugaison ATG12 Système de conjugaison LC3 Lié à la membrane Récepteur de l’autophagie Membrane

d’isolation Phagophore Autophagosome

Fusion avec le lysosome et dégradation du cargo Autolysosome Lysosome FIP200 Beclin 1 BCL2 VPS34 _{Beclin 1} BCL2 VPS34 Déséquilibre énergétique Carence nutritionnelle

47 formation, ces domaines enrichis en PI(3)P permettent la naissance d’une structure appelée omégasome (Ktistakis et al., 2011) (Figure 23). Le modèle actuel propose que la membrane isolée appelée phagophore et qui formera l’autophagosome émane des domaines lipidiques enrichis en PI(3)P qui constituent l’omégasome. Cependant, la source intracellulaire de cette membrane reste incertaine. Celle-ci pourrait provenir de membranes recyclées issues du RE, des mitochondries, de l’appareil de Golgi, de la membrane plasmique ou encore des endosomes, et son origine dépendrait probablement du type cellulaire ainsi que des conditions physiologiques et de croissance de la cellule (Wei et al., 2018).

Recrutement de la machinerie d’élongation : Le phagophore enrichi en PI(3)P est reconnu par le complexe WIPI (WD repeat protein interacting with phosphoinositides) constitué des protéines WIPI capables de lier les PI(3)P. Les WIPI (WIPI 1, 2 ,3 et 4) permettent de faire le lien entre la production de PI(3)P et la lipidation de la protéine MAP1LC3/LC3 (microtubule-

associated protein 1-light chain 3/light chain 3), une étape cruciale pour l’élongation du

phagophore. En effet, WIPI2 permet le recrutement du complexe ATG12-ATG5-ATG16L1 (Figure 23) et WIPI1 est essentielle pour la lipidation de LC3. WIPI4 interagit avec ATG2 et cette interaction est également importante pour la lipidation de LC3 mais reste encore mal caractérisée. Enfin, la fonction de WIPI3 reste à identifier (Proikas-Cezanne et al., 2015).

Le complexe ATG9 participe aussi à la biogenèse des membranes autophagosomales. Pendant l’induction de l’autophagie, la protéine ATG9, une protéine transmembranaire, est transportée de l’appareil de Golgi aux endosomes tardifs puis aux membranes des autophagosomes (Takahashi et al., 2011). Ce trafic pourrait permettre de fournir à la structure pré-autophagosomale des facteurs importants pour la formation des autophagosomes ou des composants lipidiques provenant des différents compartiments cellulaires (Mizushima et al., 2011).

L’élongation

L’élongation permet la capture des composants par le phagophore, dont l’expansion est assurée par l’apport de lipides mais aussi par le recrutement et l’activité de deux complexes de conjugaison, ATG12-ATG5-ATG16L1 et LC3/GABARAP (gamma-aminobutyric acid receptor-

associated protein) (Nakatogawa, 2013) (Figure 22).

Le système de conjugaison ATG12-ATG5 est formé tout d’abord par l’activation d’ATG12 par ATG7 de manière ATP-dépendante (Tanida et al., 1999), entraînant le transfert d’ATG12 vers ATG10. ATG12 se lie alors de manière covalente à la protéine ATG5 afin de former le conjugué ATG12-ATG5, libérant ainsi ATG10 (Mizushima et al., 1998). La protéine ATG16L1 s’associe ensuite de manière non covalente à ce conjugué pour former un complexe macromoléculaire ATG12-ATG5-ATG16L1 qui se situe au niveau de la membrane externe du

Figure 23 : L’initiation de la formation des autophagosomes.

Une fois activé, le complexe ULK1 est recruté sur la membrane du RE grâce à l’interaction de la protéine ULK1 avec les protéines VMP1 présentes dans la membrane du RE. Le complexe Beclin 1 est alors recruté sur la membrane du RE. La phosphorylation de la protéine BECN1 par ULK1 induit l’activation de la protéine VPS34 permettant la production de PI(3)P dans la membrane du RE. La synthèse de PI(3)P initie la formation de l’omégasome sur lequel sera recruté le complexe WIPI2 qui recrutera à son tour le complexe ATG12-ATG5-ATG16L1 nécessaire à l’élongation de l’autophagosome.

48 phagophore et se dissocie dès la fermeture de ce dernier (Mizushima et al., 2003). Ce complexe est essentiel au processus autophagique, toutefois une autophagie indépendante des protéines ATG5 et ATG7 a été décrite in vitro en réponse à des stress particuliers tels qu’une exposition des cellules à une molécule génotoxique, l’étoposide, et in vivo lors de la dégradation des mitochondries pendant la maturation des érythrocytes au cours de l’embryogenèse murine (Nishida et al., 2009).

Le système de conjugaison LC3/GABARAP : Il existe deux familles de protéines capables d’être lipidées, LC3 (comprenant LC3A, B, B2 et C) et GABARAP (comprenant GABARAP, -L1, -L2). Toutes ces protéines sont lipidées selon le même principe impliquant les systèmes de conjugaison ATG12-ATG5-ATG16L1 et LC3/GABARAP (Nath et al., 2014). Pour simplifier la lecture, ces protéines seront regroupées sous le terme LC3 pour le reste de ce manuscrit. La protéine LC3 non mature, appelée pro-LC3 est clivée par la protéase ATG4 et donne la forme cytosolique LC3-I pouvant être activée par ATG7 puis transférée à ATG3 avant d’être liée de manière covalente à un phospholipide membranaire, le PE afin de former le complexe LC3-PE ou LC3-II (Kabeya, 2000). Bien que le substrat principal d’ATG12 soit ATG5, ATG12 peut également s’associer à ATG3 pour permettre la lipidation de LC3 (Radoshevich et al., 2010). Contrairement au complexe ATG12-ATG5-ATG16L1, la forme LC3-II est présente aussi bien au niveau des membranes externes que des membranes internes du phagophore et est primordiale dans les dernières étapes de la formation du phagophore fermé (ou autophagosome) (Kabeya, 2000). Tandis que le LC3-II associé à la membrane externe pourra être délipidé et recyclé au cours de la maturation, la forme LC3-II associée à la membrane interne du phagophore ne sera pas dissociée et sera donc dégradée lors de sa fusion avec les lysosomes (Yu et al., 2012). Ces caractéristiques font de LC3-II un marqueur de choix pour l’étude de l’autophagie (Klionsky et al., 2016). Le complexe ATG12-ATG5-ATG16L1, en augmentant l’activité d’ATG3, participe à l’étape de lipidation de LC3 (Hanada et al., 2007; Lystad et al., 2019).

La maturation et la dégradation du contenu par le lysosome

L’élongation des extrémités du phagophore conduit à sa fermeture pour donner un autophagosome d’environ 0,5 à 1,5 µm de diamètre (Mizushima et al., 2002). La maturation de l’autophagosome requiert l’activité d’ATG4 pour dissocier le complexe LC3-II de la surface externe de l’autophagosome et éviter l’accumulation d’autophagosomes incomplets et non fermés dans la cellule (Yu et al., 2012). Le mécanisme impliqué dans la fermeture du phagophore s’apparenterait à une scission membranaire puisque les faces externe et interne de la double- membrane ne sont pas en contact lors de la fermeture (Knorr et al., 2015). Une fois fermé, l’autophagosome peut fusionner directement avec le lysosome pour donner un autolysosome ou bien fusionner séquentiellement avec un endosome pour donner une vacuole intermédiaire appelée

49 amphisome qui fusionne alors avec le lysosome pour former l’autolysosome. Ces événements conduisent à l’acidification de la vacuole et à la dégradation du contenu intra-luminal et de la membrane interne par les enzymes lysosomales (Zhao and Zhang, 2019). Ces produits de dégradation seront ensuite libérés dans le cytosol, grâce à des transporteurs lysosomaux et recyclés par la cellule (Tong et al., 2010). Une réactivation de la protéine kinase mTOR (mammalian target

of rapamycin), régulateur négatif majeur de l’autophagie, permettrait de recycler les lysosomes

engagés dans la maturation de l’autophagosome (Yu et al., 2010).