Isolement et caractérisation des exosomes

L’isolement des exosomes à partir de fluides biologiques ou de surnageant de cellules en culture peut être réalisé par différentes méthodes (Tableau 9). Cependant, aucun consensus n’a pu être établi quant à la méthode à privilégier puisqu’aucune d’entre elles ne garantit à 100 % la séparation des exosomes des autres types de vésicules (Soares Martins et al., 2018). L’ultracentrifugation est la méthode la plus communément utilisée et permet l’obtention d’exosomes relativement purs mais cette procédure longue nécessite de posséder l’équipement approprié et semble peu reproductible entre les laboratoires (Li et al., 2017). De plus, le rendement en exosomes est faible et l’isolement à partir de certains fluides biologiques nécessite une centrifugation à très haute vitesse sur une longue période, compromettant l’intégrité des exosomes (Momen-Heravi et al., 2012). De nombreuses autres méthodes d’isolement des exosomes existent telles que la filtration, la chromatographie d’exclusion de taille, l’isolement par immuno-affinité, l’utilisation de dispositifs microfluidiques, l’isolement par gradient de densité ainsi que l’utilisation de réactifs commerciaux basés sur l’utilisation de polymères (Li et al., 2017). La chromatographie d’exclusion de taille résultant en différentes fractions de vésicules permet l’obtention d’exosomes purs, cependant les exosomes obtenus sont forcément dilués et ces procédures sont relativement

Tableau 10 : Principales méthodes d’analyse des vésicules extracellulaires. D’après Chiriacò et al., 2018.

Méthode de

caractérisation Information obtenue Avantages Inconvénients

Microscopie électronique Taille et morphologie des exosomes - Observation directe de la taille et de la morphologie - Modifications possibles de la taille et de la morphologie dues à la préparation de l'échantillon

- Efficace à partir de peu de matériel

- Procédure longue - Utilisation d'anticorps

spécifiques des marqueurs exosomaux Microscopie à force atomique Topographie tridimensionnelle des exosomes - Pas de fixation ni de coloration de l'échantillon - Modifications possibles de la taille et de la morphologie dues à la deshydratation - Efficace à partir de peu de

matériel

de l'échantillon sur mica Analyse par diffraction de

la lumière

Distribution de la taille des exosomes

- Préservation de

l'échantillon pour les analyses en aval

- Imprécis si les échantillons sont de taille hétérogène - Rapide

- Pas de préparation de l'échantillon

Suivi individuel des nanoparticules

Concentration et

distribution de la taille des exosomes

- Préservation de

l'échantillon pour les analyses en aval

- Imprécis si les échantillons sont de taille hétérogène ou en cas d'aggrégats de

- Rapide particules

- Pas de préparation de l'échantillon

Détection des pulsations de résistance

Concentration, distribution de la taille et charge des EV

- Rapide - Difficile si la taille des particules est inconnue et hétérogène

- Pas de préparation de l'échantillon

- Détection de matériel non vésiculaires de taille similaire Cytométrie en flux Caractérisation des

marqueurs exosomaux et dénombrement absolu - Caractérisation quantitative et qualitative - Limite de détection dépendante du cytomètre en flux - Détection de plusieurs vésicules comme un seul événement

- Détection des agrégats protéiques

ELISA/western blot Quantification des protéines exosomales

- Méthodes immunologiques standard

- Détection possible de protéines non exosomales - Caractérisation spécifique

des marqueurs protéiques exosomaux

- Pas d'informations spécifiques sur la

concentration, la taille et la distribution des exosomes

76 longues (Li et al., 2017). Les solutions commerciales basées sur l’utilisation de polymères offrent une méthode d’isolement facile et rapide des exosomes par centrifugation à faible vitesse ne nécessitant aucun équipement spécialisé et ayant un bon rendement, mais peuvent parfois interférer avec les analyses réalisées en aval (Li et al., 2017). Enfin, quelques équipes s’attellent à adapter les techniques de purification des exosomes existantes aux technologies de « laboratoire sur puce » permettant une consommation moindre d’échantillon par analyse, une réduction des coûts comparativement à celui des équipements de paillasse nécessaires, mais également une automatisation des analyses permettant de meilleures performances et une plus grande précision adaptable aux tests cliniques, favorisant ainsi le développement des thérapies personnalisées (Chiriacò et al., 2018).

Les exosomes peuvent être visualisés et caractérisés par différentes techniques physiques ou biochimiques (Tableau 10). Etant donné la petite taille des exosomes, la microscopie électronique (ME) à transmission est la seule technique permettant l’observation directe de la morphologie et de la taille des exosomes. Les exosomes peuvent être simplement observés après fixation sur des lames, colorés et contrastés aux métaux lourds, mais cette technique peut être combinée à l’utilisation d’anticorps couplés à des nanoparticules d’or permettant la détection de marqueurs spécifiques (immuno-ME) (Chuo et al., 2018). D’autres techniques de ME telles que la ME à balayage, dont la préparation des échantillons requiert moins d’étapes que pour la ME à transmission, la cryo-ME, limitant l’altération de la structure des exosomes due à l’utilisation de produits chimiques déshydratants ou encore la microscopie à force atomique permettent de caractériser la structure tridimensionnelle des exosomes (Chuo et al., 2018). Les exosomes peuvent être analysés de manière quantitative et qualitative par cytométrie en flux, cependant, cette technique nécessite l’adsorption des exosomes sur des particules portant des anticorps spécifiques fluorescents ou des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques connues comme étant enrichies sur les exosomes afin que ceux-ci soient distingués du bruit de fond (Hartjes et al., 2019). La distribution de la taille des vésicules par suivi individuel des particules (ou nanoparticle tracking

analysis) permet également de déterminer la concentration et la taille des vésicules d’un échantillon

fluorescent ou non, cependant, la présence d’autres éléments dans la suspension d’exosomes, tels que des agrégats protéiques, peut fausser les résultats (Hartjes et al., 2019). Une technique similaire, l’analyse de la diffusion dynamique de la lumière (ou dynamic light scattering), permet le calcul de la taille moyenne des particules dans un échantillon, mais nécessite de travailler sur un échantillon très pur (Hartjes et al., 2019). Différentes techniques telles que le western blot ou l’analyse par immunoaffinité permettant de caractériser biochimiquement les exosomes. L’analyse des marqueurs protéiques exosomaux par western blot est une technique simple et rapide à mettre en œuvre mais nécessitant un assez gros volume d’échantillon. Ces marqueurs peuvent également être

Figure 34 : Biogenèse des exosomes.

(1) Suite à l'endocytose, l’endosome précoce pouvant contenir des récepteurs extracellulaires tels que les récepteurs à la transferrine (2) est maturé en endosome tardif. (3) Des VIL formées par invagination de la membrane interne des endosomes précoces et capturant au passage des ARN et protéines cytosoliques s'accumulent dans la lumière des endosomes tardifs, alors appelés EMV. (4) Les EMV peuvent alors soit fusionner avec les lysosomes, entraînant la dégradation de leur contenu, (5) soit fusionner avec la membrane plasmique, provoquant le relargage des VIL dans le milieu extracellulaire, (6) vésicules alors nommées exosomes (modifiée d'après Schorey et al., 2015).

Endosome précoce Récepteurs à la transferrine Exosomes Exocytose Dégradation Noyau Protéines cytosoliques ARN Endocytose Endosome tardif (EMV) VIL 6 1 2 3 4 5

77 analysés par ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), une technique facile à mettre en œuvre, spécifique, pouvant être miniaturisée sur puce (ExoChip), ou par une méthode alternative utilisant des anticorps secondaires porteurs d’un fluorochrome (FLISA, fluorophore-linked immunosorbent

assay) (Hartjes et al., 2019). Enfin, le profil protéique des exosomes peut être déterminé par

spectrométrie de masse (Bandu et al., 2019), leur profil lipidique peut être établi par chromatographie sur couche mince ou en gaz-liquide et par spectrométrie de masse (Skotland et al., 2017), et leur composition en acides nucléiques peut être analysée par séquençage nouvelle génération ou RT-PCR quantitative (RT-PCRq) (Kim et al., 2017b).