Lsd1, Lsd2 et Sap1 lient la chromatide qui porte l'empreinte

Afin de réaliser la même analyse sur les IP de Lsd1, Lsd2 et Sap1, j'ai utilisé les ChIP-séq qui ont été réalisées dans les fonds génétiques mat1M ∆2-3 et mat1P ∆2-3. À la différence d'Abp1, ces protéines sont recrutées à l'intérieur de mat1, et l'utilisation de ces souches au lieu de la souche h90 permet d'éviter la répartition aléatoire des lectures au niveau des donneurs mat2P et mat3M.

En absence de l''empreinte, la distribution théorique des 5' comptes d'une protéine se fixant du côté centromère proximal du site de l'empreinte est présentée figure 37A. Deux gaussiennes de 5' comptes enrichis seront présentes à une distance égale la taille des fragments générés à la sonication.

En présence de l'empreinte, l'ADN casse dans un premier temps au niveau de ce site comme présenté sur la figure 37B. La distribution des 5' comptes enrichis du brin Crick sera donc restreinte autour du site de l'empreinte. Celle des 5' comptes du brin Watson sera également restreinte. Elle sera séparée de la distribution des 5' comptes enrichis du brin Crick par la distance égale à la taille moyenne des fragments produits par la sonication.

Dans les différents fonds génétiques capables de changer de type sexuel, environ la moitié des cellules aura une empreinte. Le résultat de l'analyse de l'IP de Lsd1, Lsd2 et Sap1 dans une souche mat1M ∆2-3 devrait donc être un mélange des deux types de distributions. Dans un fond génétique mat1P ∆2-3, nous devrions observer le même résultat pour les protéines enrichies à savoir Lsd1 et Lsd2. Sap1 ne se liant pas au niveau de cet allèle, nous ne devrions pas observer de 5' comptes enrichis autour du locus mat1P dans cette IP.

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Figure 37 : Distributions théoriques des 5’ comptes des IP Lsd1-2 et Sap1 en fonction de la présence de l'empreinte.

En noir les 5' comptes du brin Watson et en gris ceux du brin Crick. Les protéines Lsd1-2 et Sap1 sont représentées par le rectangle bleu. Les sites cassés au cours de la sonication sont marqués par une flèche rouge. A) Résultat théorique de l'analyse des 5' comptes de l'IP de Lsd1-2 et Sap1 sur une chromatide sans empreinte et en B) sur une chromatide avec empreinte. Quand l'allèle M est à mat1, les distributions des 5’ comptes des IP de Lsd1, Lsd2 et Sap1 sont similaires, mais sont différentes de la distribution théorique (figure 38A). En effet, de façon surprenante le 5’ compte du brin Watson au site de l'empreinte est enrichi par rapport au WCE dans les IP de Lsd1/2 et Sap1 dans le fond génétique mat1M ∆2-3 (figures 37A et 37C). Cela indique que ces protéines sont capables d'immunoprécipiter le fragment distal portant l'empreinte.

En revanche, les distributions des 5’ comptes enrichis du brin Watson et Crick sont effectivement un mélange de celles attendues avec et sans empreinte (figure 37 et figure 38B). À l'intérieur de mat1M, à environ 300 pb du site de l'empreinte, les 5’ comptes du brin Watson sont plus élevés. Autour du site de l'empreinte, une partie des 5’ comptes du brin Crick sont plus élevés, et à 300 pb de ce site, une autre partie de ces 5' comptes est enrichie.

Ainsi, dans les IP des protéines Lsd1, Lsd2 et Sap1, il semble que trois types de distributions soient présentent : (figure 38D)

- la distribution d'une protéine se fixant à l'intérieur de mat1M sans empreinte ; - la distribution d'une protéine se fixant à l'intérieur de mat1M avec empreinte ;

145 - la distribution d'une protéine se fixant à l'extérieur (centromère distal) de mat1M avec empreinte.

Enfin, nous ne pouvons pas savoir si la distribution d'une protéine se fixant à l'extérieur (centromère distal) de mat1M sans empreinte est aussi présente, puisque les enrichissements en 5' comptes de cette distribution seront confondus avec les autres distributions.

Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent qu'un repliement spécifique de la chromatine est formé et permet aux protéines qui se fixent à l'intérieur de l'allèle M, d'immunoprécipiter le fragment distal portant l'empreinte (figure 38E).

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Figure 38 : Analyse des 5’ comptes au niveau de l'empreinte dans les IP de Lsd1/2 et Sap1.

A) Les lignes nommées, Couverture IP, représentent la couverture des lectures d'ADN des ChIP-séq de Lsd1, en bleu, de Lsd2, en vert, et de Sap1, en rouge, dans le fond génétique mat1M ∆2-3. La séquence utilisée pour l'alignement est une région de 10 kb contenant l'allèle M à mat1. Les lignes nommées "Watson" sont les 5’ comptes du brin Watson et celle nommées "Crick" des 5’ comptes du brin Crick et cela pour chacune des ChIP-séq indiquées. Les flèches indiquent la position du 5’ compte du brin Watson enrichi au site de l'empreinte (M). B) Même qu'en A) avec une échelle différente pour les 5' comptes. Les lignes rouges indiquent les 5' comptes enrichis. C) Enrichissements normalisés du 5’ compte à l'empreinte des ChIP-séq de Lsd1, de Lsd2 et de Sap1 dans une souche mat1M ∆2-3. La taille de la banque ainsi que le 5’ compte des WCE sont pris en compte dans la normalisation. D) Schéma représentant le résultat de l'analyse des 5' comptes de l'IP des protéines étudiées se fixant à l'intérieur de mat1M et à l'extérieur dans les contextes mat1M ∆2-3. E) Schéma représentant le recrutement de Lsd1/2 et Sap1 à mat1M en fonction l'empreinte suggérant un recrutement de ces protéines du côté centromère distal de l'empreinte.

147 Pour la protéine Lsd1, les distributions des 5’ comptes sont globalement comparables quand les allèles P ou M sont présents à mat1 de quand l'allèle M (figures 38A et 38B). Lsd1 est capable de lier le fragment distal qui porte l'empreinte quand l'allèle est P à mat1 (figure 39B). Lsd2 semble moins enrichie à mat1P par rapport à mat1M. En effet, nous remarquons que la molécule qui porte l'empreinte est moins enrichie dans l'IP de Lsd2 quand l'allèle à mat1 est P (figure 39B comparée à 38C). La molécule qui porte l'empreinte n'est pas enrichie dans l'IP de Sap1, ce qui corrobore le fait que Sap1 n'est pratiquement pas recrutée à l'intérieur de mat1P (figures 39A et 39B). Ces résultats montrent que Lsd1 et Lsd2 sont recrutées à mat1P et notamment en présence de l'empreinte.

L'ensemble de ces résultats suggère que les allèles M et P permettent tous deux la formation d'un repliement de la chromatine reconnu par Lsd1 et Lsd2. Seule la protéine Sap1 est recrutée préférentiellement au niveau de l'allèle M (figures 38E et 39C).

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Figure 39 : Analyse des 5’ comptes au niveau de l'empreinte dans les IP de Lsd1, Lsd2 et Sap1.

A) Les lignes nommées, Couverture IP, représentent la couverture des lectures d'ADN des ChIP-séq de Lsd1, en bleu, de Lsd2, en vert, et de Sap1, en rouge, dans le fond génétique

mat1P ∆2-3. La séquence utilisée pour l'alignement est une région de 10 kb contenant l'allèle P

à mat1. Les lignes nommées "Watson" sont les 5’ comptes du brin Watson et celle nommées "Crick" des 5’ comptes du brin Crick et cela pour chacune des ChIP-séq indiquées. Les flèches indiquent la position du 5’ compte du brin Watson enrichi au site de l'empreinte (M). B) Enrichissements normalisés du 5’ compte à l'empreinte des ChIP-séq de Lsd1, de Lsd2 et de Sap1 dans une souche mat1P ∆2-3. La taille de la banque ainsi que le 5’ compte des WCE sont pris en compte dans la normalisation. C) Schéma représentant le recrutement de Lsd1/2 à mat1P en fonction l'empreinte suggérant un recrutement de ces protéines du côté centromère distal de l'empreinte.

149 4.4 Conclusions

En utilisant des séquençages génomiques ne résultant pas d'une immunoprécipitation, nous constatons qu'il est possible de cartographier un site fragile grâce à la détection d'un nombre accru d'extrémités 5' de lectures qui démarrent au site de la discontinuité. L'étude de l'empreinte au locus sexuel nous a permis de montrer qu'un ADN avec une discontinuité simple chaine ne casse pas exactement en face de cette lésion lors de la sonication. La caractéristique d'une telle lésion sera donc, un enrichissement en 5' comptes sur l'un des deux brins à un site précis et un enrichissement en 5' compte aux alentours de ce site sur le brin opposé (ici Watson et Crick, respectivement).

D'autre part, la séquence d'ADN est importante dans cette analyse. En effet, nous observons des différences notables en fonction de l'allèle présent à mat1. Par exemple, quand l'information M est présente à mat1, le compte des 5' est enrichi au niveau du site de l'empreinte sur le brin Watson alors que quand l'information à mat1 est P, le 5' compte à ce site n'est enrichi que dans 3 des 4 génomes testés. Ces disparités peuvent être liées à la profondeur ainsi que la taille du séquençage.

Les résultats de cette analyse faite sur les ChIP-séq suggèrent que les protéines présentes à l'intérieur du locus mat1 sont également capables de lier le fragment distal portant l'empreinte. Nous pourrions imaginer que la structure de la chromatine autour de l'empreinte permet un contact entre les protéines à l'intérieur de mat1 et la chromatine du côté centromère distal. Cette conformation pourrait notamment jouer un rôle dans la stabilisation de l'empreinte.

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