Enrichissement d'Abp1 : sauvage vs swi1∆
5. Contrôle de la réplication de wtf9
Un des projets du laboratoire consiste à déterminer l'implication de la protéine Lsd1 au niveau de la réplication. Un complexe contenant Lsd1 a été isolé par différents laboratoires, et il est composé des protéines Lsd1, Lsd2, Phf1 et Phf2 (Gordon et al., 2007; Lan et al., 2007; Nicolas et al., 2006). Lsd1 est décrit comme contrôlant la transcription de certains gènes, mais également comme contrôlant la propagation de l'hétérochromatine (Gordon et al., 2007; Lan et al., 2007; Nicolas et al., 2006). De plus, le laboratoire a montré que Lsd1 contrôle également la réplication à mat1 (Holmes et al., 2005). Cependant, la cible de cette protéine n'a pas encore été identifiée.
En absence de Lsd1, la cellule est très malade et pousse très lentement. En utilisant ce phénotype, un crible a pu être réalisé. Des cellules lsd1∆ ont été étalées sur boite, et les colonies formées ont été repiquées jusqu'à l'obtention de colonies à croissance plus rapide. L'ADN de ces colonies a ensuite été préparé puis séquencé afin de déterminer les mutations responsables de la suppression du défaut de croissance du mutant lsd1∆. Vingt-quatre suppresseurs ont ainsi été isolés. Une analyse de la présence de duplications réalisée par Béatrice Regnault a montré que quatorze des vingt-quatre suppresseurs contiennent une duplication au niveau du chromosome 3. L'analyse fine de ce réarrangement par le Dr Singh, un post-doctorant du laboratoire, a montré une duplication d'une région d'au moins 60 kb portant le gène phf1. Le produit de ce gène (Phf1) est retrouvé dans le complexe formé par Lsd1, Lsd2 et Phf2. Le fait qu'une majorité des mutants isolés contiennent cette duplication et que Lsd1 participe au contrôle de la réplication nous a amené à penser que Lsd1 pourrait influencer la réplication au niveau des bordures de la duplication sur le chromosome 3. En l'absence de Lsd1, la formation de duplications serait facilitée. Mon implication dans ce projet a été de caractériser l'influence de Lsd1 sur la réplication au niveau de la bordure de la duplication isolée.
5.1 Caractérisation de la duplication du bras gauche du chromosome 3
La duplication présente dans les différents mutants est comprise entre deux gènes appartenant à la famille des "wtf" (With Tf) : wtf8 et wtf9. La famille de gènes wtf a été découverte chez
S. pombe (Wood et al., 2002). Au total, vingt-cinq séquences wtf sont présentes dans le génome
de S. pombe. Ces séquences ont été nommées ainsi car des LTRs sont très souvent retrouvés à leurs côtés (Bowen et al., 2003). La région dupliquée s'étend sur 60 kp sur le bras gauche du chromosome 3 (figure 40A). L'analyse des bordures de cette duplication a montré qu'elle consiste en une fusion de wtf8 et de wtf9 (figure 40B et données non montrées). La cartographie
151 par PCR suivie de séquençage Sanger des bordures montre que le dernier site utilisé pour la recombinaison est situé dans le LTR n°3 (figure 40C). Ces données suggèrent que ce dernier site serait l'endroit où la fourche de réplication casserait pour initier la RH. J'ai donc analysé la réplication au niveau du LTR n°3.
Figure 40 : Schéma de la région dupliquée.
A) Schéma de la région du bras gauche du chromosome 3 contenant wtf8, en vert, phf1, en gris et wtf9, en bleu. La distance séparant chaque gène est indiquée en kb. B) Représentation de la duplication observée chez les mutants suppresseurs. C) Zoom sur le locus wtf9 qui contient la bordure de la duplication. Les LTRs sont numérotés. Le site de la bordure la plus extrême est indiqué par une flèche.
5.2 Lsd1 contrôle-t-elle la réplication de wtf9 ?
L'analyse de la propagation de la fourche de réplication au niveau des LTRs a montré que ce sont des régions difficiles à répliquer, et que des pauses de la fourche de réplication peuvent être observées. J'ai, dans un premier temps, déterminé si une pause de la fourche de réplication était observable au niveau de la bordure de cette duplication. Pour ce faire, j'ai analysé l'accumulation d'intermédiaires de réplication par gel bidimensionnel d'agarose (figure 41). Les résultats suggèrent que la fourche de réplication fait une pause au niveau de wtf9 (figure 41B). D'autre part, la mutation lsd1-18 (mutation ponctuelle dans le domaine HMG de lsd1) ne semble pas affecter la progression de la fourche de réplication (figure 41C). Le résumé des différentes analyses nous suggère que la mutation lsd1-18 n'affecte pas la réplication de wtf9 à la différence de ce qui est observé à mat1 (figure 41D).
Ces résultats sont en accord avec les résultats de ChIP-séq qui ont été à notre disposition plus tardivement. En effet, Lsd1 n'est pas enrichie au niveau de wtf9 ou de wtf8 (figure 42). Ces résultats excluent le fait que Lsd1 contrôle directement la fourche de réplication à ces loci.
152 Comme déjà souligné précédemment, Abp1 et Sap1 sont présentes au niveau des LTRs adjacents à wtf9 (figure 42). Cependant, des résultats préliminaires d'analyse de la réplication suggèrent qu'Abp1 ne contrôle pas la fourche de réplication au niveau de wtf9 (figure 41D).
Figure 41 : Lsd1 ne contrôle pas la réplication au niveau de wtf9.
A) Schéma de la région du bras gauche du chromosome 3 contenant wtf9. Les sites des enzymes de restriction utilisés sont indiqués. La taille des fragments obtenus ainsi que la sonde utilisée sont notés. B) Analyse des intermédiaires de réplication dans la souche sauvage au niveau de
wtf9. Les enzymes de restriction utilisées sont indiquées. C) Analyse des intermédiaires de
réplication dans la souche sauvage et lsd1-18 au niveau de wtf9. Deux digestions enzymatiques ont été testées. D) Résumé des différentes analyses. La quantification du signal d’hybridation est le rapport du signal (pause / arc total).
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Figure 42 : Lsd1 ne contrôle pas directement la réplication au niveau de wtf9.
A) Distribution des enrichissements normalisés (IP RPkM / WCE RPkM) des ChIP-séq de Lsd1, Lsd2, Sap1 et Abp1 dans le fond génétique h90. Les loci wtf8, phf1 et wtf9 sont indiqué. B) Agrandissement du locus wtf9. Sap1 et Abp1 sont enrichies du côté droit de wtf9.
5.3 Conclusions
Les données d'analyses des intermédiaires de la réplication et de ChIP-séq au niveau de la région comportant la duplication de phf1 montrent que Lsd1 ne contrôle pas directement la réplication de ce locus. Le fait que dans le crible effectué quatorze des vingt-quatre mutants isolés comportent cette duplication indique un fort avantage sélectif. De plus, d'autres duplications n'impliquant pas wtf8 et wtf9 ont été détectées (données non montrées). Ces duplications, contrairement à celle de phf1, n'ont pas d'effet suppresseur sur la croissance très ralentie des mutants lsd1∆. Le fait que des mutations "passagères" soient mises en évidence suggère qu'en absence de lsd1 le contrôle du nombre de copies de différents loci est affecté. Le mécanisme sous-jacent n'est pour le moment pas connu.
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