Chapitre IV] Discussion et perspectives
6) Généralités sur la méthylation de l’ADN
7.4 Le LPS chez S. enterica
Chez S. enterica, la longueur de l’antigène O est variable. Il a été montré que dans une culture de bactéries, on retrouve deux sous populations, une avec une chaine courte et une
Figure 17 : Représentation de la région promotrice d’opvAB avec les sites GATC (bleu) et les sites de liaison d’OxyR (OBS, jaune) représentés (Cota et al., 2016).
Figure 18 : Modèle de la variation de phase d’opvAB (Cota et al., 2016).
L’état de méthylation est représenté pour les sites GATC de la région promotrice par un carré blanc (non méthylé) ou un carré noir (méthylé) en phase OFF et en phase ON.
avec une chaine plus longue (Cota et al., 2012). Les gènes responsables de cette variation ont été nommés opvAB et démontrés comme régulés dans leur expression par un switch dans lequel intervient le régulateur OxyR et la MTase Dam (Cota et al., 2012). Dans la sous-population à chaîne courte, l’opéron opvAB est OFF et à l’inverse lorsque la chaîne latérale O est plus longue, l’opéron est exprimé (Cota et al., 2012). La réduction de la chaîne O va conférer à Salmonella une résistance aux bactériophages mais aussi une sensibilité au sérum, une diminution de la capacité à se multiplier dans les macrophages et une baisse de pathogénicité chez la souris (Cota et al., 2012 ; Cota et al., 2015). Dans la région promotrice de opvAB on trouve 4 sites de fixation de OxyR et 4 sites GATC reconnus par Dam (Fig. 17, Cota et al., 2016). Selon les sites sur lesquels OxyR se fixe, il y a expression ou non de l’opéron. OxyR est une protéine régulatrice sensible au stress oxydatif auquel elle réagit par un changement de configuration. En présence d’H2O2 OxyR va faciliter la liaison de l’ARN polymérase et donc activer la transcription alors qu’à l’inverse sous sa forme non oxydée cette protéine va agir en tant qu’inhibiteur transcriptionnel (Chiang and Schellhorn, 2012). OxyR est de plus décrit comme sensible à la méthylation puisqu’il se lie avec moins d’affinité lorsqu’un site GATC méthylé est présent dans la séquence qu’il reconnait. Ce régulateur a été décrit comme inhibiteur dans le cas d’agn43 chez E. coli (Haagmans and Van der Woude, 2000) et à la fois inhibiteur et activateur pour gtr chez Salmonella (Broadbent et al., 2010). Le mécanisme de régulation est le suivant, Les sites GATC sont numérotés de 1 (5’ du promoteur) à 4 (3’ du promoteur) et de A à D pour les sites de fixation d’OxyR (OBS pour
OxyR Binding Site) (Fig. 17, Cota et al., 2016). Lorsque l’opéron est OFF, OxyR est lié aux sites
OBS A et C, les sites GATC 1 et 3 sont non méthylés et à l’inverse les sites GATC 2 et 4 (respectivement situés dans les OBS B et D) sont eux méthylés. A l’inverse, lorsque les sites GATC 2 et 4 ne sont pas méthylés, OxyR peut se lier aux OBS B et D, la liaison de l’ARN polymérase est alors possible et l’opéron passe en phase ON (Fig. 18, Cota et al., 2016). D’autres facteurs sont impliqués dans la régulation de ce switch comme la protéine SeqA ou la protéine « Histone like » HU (pour « Heat Unstable ») mais je ne détaillerai pas cela ici (voir Cota et al., 2016 pour détail).
8) Objectifs de la thèse
Suite à la lecture de ces publications, nous nous sommes interrogés sur plusieurs points concernant notre modèle biologique. La méthylation de l’ADN par Dam joue un rôle important dans de nombreux phénotypes chez diverses bactéries pathogènes. Notre
bactérie alterne entre virulence et symbiose avec ses deux hôtes eucaryotes. A notre connaissance, aucune étude n’a étudié l’impact de la méthylation de l’ADN dans un cycle similaire. En se basant sur l’hypothèse que Photorhabdus produisait une MTase Dam nous avons donc premièrement voulu étudier son potentiel rôle dans le cycle de vie de
Photorhabdus. Pour répondre à cette question, il nous fallait modifier l’expression de cette
MTase (par mutation ou surexpression du gène). L’étude des variations phénotypiques de cette souche pourrait nous fournir des pistes de gènes sujets à la régulation par la méthylation de l’ADN. La vérification de cette hypothèse nécessitait l’appui d’une étude transcriptomique (RNAseq) qui permettrait de voir la globalité des gènes dont l’expression changerait sans nécessairement être associé à desphénotypes facilement observables. Afin d’étudier l’impact de la méthylation sur le cycle de notre modèle, il fallait aussi que nous testions la pathogénicité ainsi que la capacité à établir une symbiose de cette souche. L’ensemble de ces travaux a été réalisé durant cette thèse et a permis d’établir un bon état des lieux du rôle de la méthylation par Dam chez notre modèle (Chapitre II]). Dans un second temps, bien que la modification de l’expression de Dam soit connue pour jouer un rôle sur la méthylation des sites GATC nous nous devions de vérifier par nous même l’état de méthylation des sites GATC chez notre bactérie et de déterminer si cet état général variait lors d’une expression différente de Dam. Nous avons donc réalisé une analyse du méthylome (Chapitre III]). Pour comprendre notre modèle bactérien et le rôle de la méthylation de l’ADN chez Photorhabdus, nous avons aussi décidé de réaliser la même étude dans différentes phases de croissance ainsi que dans la sous-population résistante aux peptides antimicrobiens. L’intérêt était de chercher des conditions où une variation dans la méthylation de l’ADN (que ce soit par Dam ou tout autre méthyltransférase) pourrait être observée. Cette étude pouvait aussi nous donner des pistes sur d’autres MTases importantes chez notre bactérie modèle et a composé la seconde partie de ma thèse. Les perspectives consécutives à ma thèse seront discutées dans une dernière partie où je mettrai aussi en parallèle l’ensemble des résultats obtenus publiés ou non (Chapitre IV]).